基因、蛋白標(biāo)記物對急性冠脈綜合征危險評估的初步研究.pdf

1、冠狀動脈疾病(CAD)是多數(shù)發(fā)達(dá)國家45歲以上人群常見的心血管疾病。急性冠脈綜合征(ACS)是CAD中最危急的發(fā)病類型，包括不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)及非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)、ST段抬高型心肌梗死(STEMI)，不穩(wěn)定性動脈粥樣硬化斑塊破裂引起血栓形成，使相關(guān)動脈發(fā)生不完全或完全性閉塞是其發(fā)病的主要機(jī)制。ACS病死率仍很高，生存者則由于慢性心力衰竭或難治性心律失常等并發(fā)癥的發(fā)生使生活質(zhì)量很差。 文獻(xiàn)指出多基因性狀和

2、復(fù)雜的環(huán)境因素長期交互作用是CAD/ACS的致病基礎(chǔ)之一，呈明顯“家族性”發(fā)病。因此，預(yù)防CAD/ACS的發(fā)生是重要的公共健康問題，篩選疾病相關(guān)的易患基因可能是有效的方法之一。血小板反應(yīng)素-1(thrombospondin-1，TSP-1)是一種主要由激活的血小板分泌的基質(zhì)糖蛋白，與血小板的黏附和聚集、血管新生、平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用有關(guān)，新近文獻(xiàn)報道編碼TSP-1基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是CAD/AC

3、S發(fā)生的重要預(yù)測因子。 炎癥是CAD/ACS動脈硬化的病理基礎(chǔ)，斑塊破裂伴血栓形成是ACS發(fā)病機(jī)制。氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow-densitylipoprotein，OXLDL)是斑塊重要成分，在動脈硬化發(fā)生、發(fā)展中起重要推動作用。C反應(yīng)蛋白(oxidizedlow-densitylipoproteinCreactiveprotein,CRP)是一個非特異的炎性標(biāo)記物，CRP濃度在ACS中是增加的，最近證據(jù)表明，C

4、RP不僅僅是炎癥標(biāo)記物，而且可能參與冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程，可能的機(jī)制包括誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞存活與分化，激活動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜和缺血心肌中的補(bǔ)體等。CRP可以識別易于發(fā)生死亡或AMI的嚴(yán)重ACS患者，有關(guān)CRP升高與ACS短期危險性關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，CRP升高能夠預(yù)測14天內(nèi)的死亡率。但關(guān)于CRP自身抗體(IgG)在ACS中的作用尚無相關(guān)研究，其免疫反應(yīng)在ACS發(fā)生發(fā)展中是促進(jìn)還是保護(hù)作用等問題

5、尚未明了，闡明了這些問題將為ACS的治療開辟新途徑。 肌鈣蛋白I或T(cTnI、cTnT)已經(jīng)被ESC/ACC(歐洲心臟病學(xué)會/美國心臟病學(xué)院)指定為判斷心肌損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。ACS患者肌鈣蛋白水平的增高被認(rèn)為是判斷近期和遠(yuǎn)期愈后不良的可靠指標(biāo)，有文獻(xiàn)報道肌鈣蛋白水平增高是ACS患者應(yīng)積極進(jìn)行早期血運(yùn)重建的預(yù)測指標(biāo)。 本文旨在探討TSP-1基因SNPs與中國華東地區(qū)蘇皖交界區(qū)漢人ACS的相關(guān)性；外周血OXLDL、肌鈣蛋白

6、I、CRP自身抗體等蛋白應(yīng)用于評估ACS危險度的臨床價值。研究分下述三個部分：一.TSP-1基因單核苷酸多態(tài)性在急性冠脈綜合征應(yīng)用的初步研究1.TSP-1基因突變體的構(gòu)建和鑒定 目的；利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)構(gòu)建人TSP-1第13外顯子編碼鈣結(jié)合域基因突變片斷。 方法；設(shè)計、合成兩對引物，將突變位點(diǎn)設(shè)計在引物內(nèi)，突變位點(diǎn)包含BseNI酶切位點(diǎn)，通過PCR定點(diǎn)突變技術(shù)對TSP-1基因的第13外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，將13外顯子堿

7、基8831A置換為G，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定和測序。 結(jié)果；獲得人TSP-1基因第13外顯子編碼鈣結(jié)合域突變基因片斷，經(jīng)酶切鑒定和測序分析，證實(shí)在指定位點(diǎn)引入A→G突變。 結(jié)論；成功構(gòu)建人TSP-1基因第13外顯子編碼鈣結(jié)合域基因突變片斷，為研究該位點(diǎn)突變在導(dǎo)致TSP-1蛋白的結(jié)構(gòu)、功能變化，以及進(jìn)一步研究該突變致TSP-1蛋白功能改變在ACS作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 2.TSP-1基因單核苷酸多態(tài)性與急性冠脈綜合征相

8、關(guān)性研究 目的；探討TSP-1基因SNPs與中國華東蘇皖交界地區(qū)漢人ACS發(fā)生的相關(guān)性。 方法；研究對象為ACS患者和非冠心病(NCAD)人群，分別來自江蘇省人民醫(yī)院和南京市第一醫(yī)院。ACS組患者323例，男233例，女90例，平均年齡(63.45±10.51)歲；NCAD組273例，男178例，女95例，平均年齡(62.90±11.83)歲。所有病例采集外周血，EDTA或檸檬酸鈉抗凝管收集，離心采集血漿并提取基因組總D

9、NA，于-70℃保存待檢。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)戏磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)，篩查ACS組和NCAD組TSP-1基因第13外顯子鈣結(jié)合域活性片段8831A→G，對篩查到含有突變的片段進(jìn)行序列測定，并與正常序列進(jìn)行對照分析。 結(jié)果；對照組TSP-1基因8831A→G變異頻數(shù)明顯低于西方人，與西方人群比較差異有顯著性(0.4﹪vs11﹪，P＜0.001)，不是中國華東地區(qū)漢人的SNPs位點(diǎn)；TSP-1基因8831A→G

10、不是中國華東地區(qū)漢人ACS發(fā)生的獨(dú)立危險因素(GAvsAA:OR=1.699；95﹪CI，0.309～9.348，P＞0.05)。 結(jié)論；TSP-1基因8831A→G在中國華東地區(qū)漢人中發(fā)生頻率極低，不是中國華東地區(qū)漢人的SNPs位點(diǎn)，與ACS發(fā)生無相關(guān)性。 二.肌鈣蛋白I、氧化低密度脂蛋白與急性冠脈綜合征斑塊不穩(wěn)定和愈后的相關(guān)研究 1.cTnI測定在ACS臨床應(yīng)用與評估急性冠脈事件危險性目的探討血漿cTnI濃度

11、與非ST段抬高型ACS患者冠脈病變嚴(yán)重程度和住院期間心血管事件的相關(guān)性。方法研究對象為非ST段抬高型ACS患者和穩(wěn)定型心絞痛(SAP)、NCAD人群，分別來自江蘇省人民醫(yī)院和南京市第一醫(yī)院。ACS組120例，男72例，女48例，年齡(63.1±5.8)歲，ACS組再根據(jù)血漿cTnI濃度有無增高，分為cTnI增高組(n=43)和cTnI正常組(n=77)；SAP組61例，男37例，女14例，年齡(61.3±6.2)歲；NCAD組120例，

12、男80例，女40例，年齡(60.4±4.6)歲。入選者應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的快速定量ELISA法檢測血漿cTnI濃度，ACS組患者均行冠狀動脈造影(CAG)，記錄冠狀動脈病變枝數(shù)和冠脈積分，尋找cTnI與冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系；并記錄住院期間心臟事件，包括入院24h后發(fā)生AMI，心臟性死亡，頑固性心絞痛(指應(yīng)用靜脈硝酸甘油、肝素或低分子甘素、ADP受體抑制劑、口服阿斯匹林和足量β受體阻滯劑或鈣拮抗劑應(yīng)用后每日仍有≥1次胸痛發(fā)作且伴一過性ST

13、-T改變，或需緊急PCI進(jìn)行血運(yùn)重建的)，分析cTnI與ACS患者住院期間心臟事件有無相關(guān)。結(jié)果ACS組cTnI值(1.26±0.67ng/ml)顯著高于SAP組(0.36±0.19ng/ml)和對照組(0.25±0.13ng/ml)(P＜0.001)，SAP組cTnI值與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。ACS組cTnI濃度與CAG顯示的冠脈病變積分無相關(guān)性(r=0.195，P＞0.05)。住院期間：cTnI增高的ACS組共發(fā)生

14、心臟事件13例(30.2﹪)，其中心臟性死亡1例，新發(fā)AMI2例，頑固性心絞痛6例，急診冠脈腔內(nèi)成型術(shù)(PCI)和急診冠脈旁路移植(CABG)共4例；cTnI正常的ACS組發(fā)生心臟事件2例(2.6﹪)，其中死亡0例，新發(fā)AMI1例，頑固性心絞痛1例。兩組住院心臟事件比較差異有顯著性(P＜0.001)。用單因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)血漿cTnI水平與住院期間心臟事件密切相關(guān)(OR值11.86，95﹪CI7.21-19.27，P＜0

15、.01)。結(jié)論血漿cTnI與冠狀動脈病變嚴(yán)重程度無相關(guān)性，是ACS患者危險度分層及判斷預(yù)后的重要生化標(biāo)記物，有助于冠脈不穩(wěn)定病變的識別，本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的檢測血漿cTnI濃度的快速ELISA方法準(zhǔn)確可靠。 2.氧化低密度脂蛋白與急性冠脈綜合征冠脈嚴(yán)重程度和斑塊不穩(wěn)定的相關(guān)研究 目的探討血漿OXLDL濃度與非ST段抬高型ACS患者冠狀動脈病變嚴(yán)重程度程度的關(guān)系，以及對ACS危險性的評估價值。方法研究對象為ACS患者和SAP、N

16、CAD人群，分別來自江蘇省人民醫(yī)院和南京市第一醫(yī)院。ACS組120例，男72例，女48例，年齡(63.1±5.8)歲；SAP組61例，男37例，女14例，年齡(61.3±6.2歲)；NCAD組120例，男80例，女40例，年齡(60.4±4.6)歲。利用本實(shí)驗(yàn)室制備的抗OXLDL單抗，ELISA法檢測血漿OXLDL濃度，所有ACS患者均行CAG檢查，記錄冠狀動脈病變枝數(shù)和冠脈積分。結(jié)果ACS組血漿OXLDL水平(476.03±134.8

17、6ug/ml)顯著高于SAP組(295.97±82.53ug/ml)和對照組(278.35±67.92ug/ml)(P＜0.001)；ACS組血漿OXLDL水平隨著冠脈受累血管數(shù)的增加也顯著增加(P＜0.01)，與CAG冠脈病變積分明顯相關(guān)(r=0.68，P＜0.01)；Logistic回歸分析ACS相關(guān)變量，當(dāng)納入的變量包括：年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙史、HDL、OXLDL，僅年齡、OXLDL與ACS獨(dú)立相關(guān)(P均＜0.05)。