CLM3和CLM5促進(jìn)TOLL樣受體(TLR)觸發(fā)巨噬細(xì)胞天然免疫應(yīng)答反應(yīng)及其相關(guān)分子機(jī)制的研究.pdf

1、免疫識(shí)別與免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞與分子機(jī)制是當(dāng)前免疫學(xué)研究的重要領(lǐng)域。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抗細(xì)菌、病毒等病原體入侵的“第一道防線”，而TOLL樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)以及表達(dá)TLRs的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞是天然免疫的重要的組成部分，有關(guān)TLR參與巨噬細(xì)胞免疫識(shí)別的機(jī)制以及觸發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的調(diào)節(jié)機(jī)制、特別是對(duì)于TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚，因此，參與TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的新的分子機(jī)制的

2、研究備受矚目。 作為機(jī)體重要的模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRR)，TLRs主要表達(dá)于免疫細(xì)胞包括樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞表面。TLRs通過(guò)識(shí)別表達(dá)在細(xì)菌、病毒和真菌組成物上廣譜的病原體相關(guān)分子模式，啟動(dòng)宿主抗感染的天然免疫反應(yīng)。識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)后，TLRs招募胞漿內(nèi)一系列

3、含有TIR區(qū)域的接頭蛋白，如MyD88、TIRAP(又稱作IAL)、Trif(又稱作TICAM1)和TRAM(又稱作TICAM2)。除TLR3外，TLRs家族的所有成員都可以通過(guò)MyD88依賴途徑活化，MyD88可通過(guò)活化下游的MAPKs和NF-κB來(lái)調(diào)控炎性細(xì)胞因子的分泌。TLR3和TLR4可通過(guò)活化TRIF依賴的途徑活化NF-κB，MAPKs和IRF3，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6和IFNβ等細(xì)胞因子。TLRs信號(hào)過(guò)度活化或

4、負(fù)向調(diào)控不足會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫相關(guān)性疾病和炎癥性疾病，如果活化不足將導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷。目前已發(fā)現(xiàn)的一些正向調(diào)控因子，如DC-SIGN、Ras等，和負(fù)向調(diào)控因子，如A20、SHP-1、ST2等，為維持TLRs介導(dǎo)的免疫應(yīng)答穩(wěn)定性發(fā)揮了重要的作用。由于TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)天然免疫及獲得性免疫均具有重要的調(diào)節(jié)作用，TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究對(duì)于闡明機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)理、尋找免疫調(diào)節(jié)治療的新途徑具有重要意義，因此TLRs參與免疫識(shí)別與免疫調(diào)節(jié)的

5、機(jī)制研究是當(dāng)前免疫學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。 我們研究的CLM家族分子，其最早發(fā)現(xiàn)是源于CMRF35-A單抗識(shí)別的一個(gè)淋巴細(xì)胞表面抗原，該抗原分子屬于IgSF超家族成員，含有單鏈的免疫球蛋白可變區(qū)的胞外段，跨膜段和胞內(nèi)段，基因定位于人17號(hào)染色體。后來(lái)證明，此抗CMRF-35的單克隆抗體還能識(shí)別CMRF-35分子的同源分子，這些分子結(jié)構(gòu)與CMRF-35相似，可變區(qū)與CMRF-35同源，在17號(hào)染色體上成簇分布(cluster)因而命名為

6、CD300家族。其相應(yīng)的小鼠同源分子命名為CLM(CMRF-35-Like Molecule，CLM)家族。鼠CMRF35樣分子超家族含有9個(gè)成員，位于鼠第11號(hào)染色體上，CLM1-8非常緊密地位于11E2區(qū)的250kb左右的區(qū)域，而CLM9與其他家族成員分離，位于11D區(qū)。CLM家族成員與免疫應(yīng)答、炎癥及變態(tài)反應(yīng)關(guān)系密切，首先，CLM家族成員主要表達(dá)在參與固有免疫應(yīng)答的髓系免疫細(xì)胞表面，有些成員如CLM4在脾臟等免疫器官高表達(dá)，還有如

7、CLM5在與外來(lái)抗原直接接觸的氣道和肺臟高表達(dá)；其次，多數(shù)活化性受體成員如CLM5、CLM7、CLM8在抗體交聯(lián)活化后能促進(jìn)中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞分泌炎性因子，而抑制性受體成員如CLM1或CLM8則抑制炎性反應(yīng)或免疫細(xì)胞應(yīng)答：再次，許多受體成員如CLM1/5，CLM4/8，在炎癥因子等外來(lái)刺激的細(xì)胞表面表達(dá)發(fā)生變化，提示在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起一定的正向和負(fù)向調(diào)控作用。CLM分子參與TLRs免疫識(shí)別與應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制是

8、值得研究的重要課題，目前基本上屬于空白點(diǎn)。 CLM3作為CLM家族的成員，其特征和功能都沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，本研究中我們從小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中成功克隆了CLM3的全長(zhǎng)基因，長(zhǎng)738bp堿基，編碼245個(gè)氨基酸(a．a(chǎn))的蛋白質(zhì)，推測(cè)分子量為27kDa。對(duì)其氨基酸序列分析表明，該蛋白含有長(zhǎng)17a．a(chǎn)的信號(hào)肽和22a．a(chǎn)的疏水跨膜區(qū)，胞外段含有特征性的IgV功能域(domain)，屬于Ig超家族成員，CLM3定位于小鼠11號(hào)染色體的11E

9、2區(qū)，CLM1-8非常緊密地位于該區(qū)，而CLM9與其他家族成員分離。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)與CLM3同源性較高的均為CLM家族成員，其中與CLM5和CLM1同源性最高，胞外段一致性為85％。 RT-PCR分析表明，CLM3廣泛分布于小鼠正常組織，在心、肝、脾及淋巴結(jié)等組織均有不同程度表達(dá)，其中尤以淋巴結(jié)表達(dá)水平最高，在P815、Crip、RF、CT26、YAC-1、A20、3LL、Hepa、RAW264.7等細(xì)胞株中，CLM3僅在RA

10、W264.7巨噬細(xì)胞株中表達(dá)，在新鮮分離的小鼠原代的細(xì)胞中，亦驗(yàn)證了此結(jié)果，CLM3僅在腹腔巨噬細(xì)胞中表達(dá)，這種在組織細(xì)胞的分布特點(diǎn)提示該分子在免疫防御中可能的功能。 由于許多炎性因子可以通過(guò)影響具有調(diào)控功能的分子的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的應(yīng)答，因此我們?cè)诒狙芯恐杏^察了TLRs配體LPS、polyⅠ：C、CpG ODN對(duì)CLM3分子表達(dá)的影響，然而LPS(0.1μg/ml劑量刺激)、polyⅠ：C(0.1μg/ml劑量刺激)、CpG

11、ODN(0.3μM劑量刺激)刺激至24小時(shí)，Raw264.7細(xì)胞中CLM3 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化。 CLM3究竟有何功能?是否同其他CLM家族成員一樣在免疫與炎癥中發(fā)揮重要作用?是否也參與了TLRs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)? 我們發(fā)現(xiàn)，CLM3能促進(jìn)CpG ODN誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子(TNFα和IL6)的產(chǎn)生。我們將CLM3 siRNA轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞48小時(shí)，CpG ODN(0.3μM劑量刺激)刺激6小時(shí)后，收集上清采用EL

12、ISA試劑盒測(cè)定TNF-α和IL-6表達(dá)。結(jié)果顯示，CLM3表達(dá)被干擾后，CpG ODN誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6產(chǎn)生降低。將CLM3全長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，操作步驟同上，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CLM3后，CpG ODN誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6產(chǎn)生增加。其它TLR配體如LPS刺激無(wú)明顯變化。該結(jié)果證明CLM3參與并促進(jìn)了TLR9觸發(fā)的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過(guò)程。 CLM3促進(jìn)了TLR9觸發(fā)的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制如

13、何?我們將MyD88、IRAK1、TRAF6、CLM3質(zhì)粒與TNF-α報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，24小時(shí)后檢測(cè)TNF-α報(bào)告基因活化情況。結(jié)果顯示，CLM3過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了MyD88、IRAK1、TRAF6誘導(dǎo)的TNF-α活化；同時(shí)，我們應(yīng)用TRIF、TAK1、CLM3質(zhì)粒與TNF-α報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染HEK293，24小時(shí)后檢測(cè)TNF-α報(bào)告基因活化情況。結(jié)果顯示，CLM3過(guò)表達(dá)對(duì)TRIF、TAK1誘導(dǎo)的TNF-α活化沒(méi)有顯著影響。提示

14、CLM3能通過(guò)MyD88、IRAK1、TRAF6途徑促進(jìn)TLR9的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。經(jīng)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，CLM3通過(guò)與MyD88結(jié)合來(lái)促進(jìn)后者的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提示CLM3可能通過(guò)促進(jìn)IRAK1和TRAF6或TRAF6和TAK1復(fù)合物的形成來(lái)促進(jìn)TLR9的信號(hào)傳遞。 我們又檢測(cè)了MAPK及NF-κB的活化情況，將CLM3全長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，24小時(shí)后以CpG ODN刺激，觀察MAPK的磷酸化及NF-κB的．p65亞基的入核

15、情況。應(yīng)用CpG ODN刺激過(guò)表達(dá)CLM3的巨噬細(xì)胞后，JNK、ERK的磷酸化增加，NF-κB的P65亞基較對(duì)照組入核增加，提示CLM3通過(guò)活化MAPK和NF-κB來(lái)調(diào)控細(xì)胞因子的產(chǎn)生。 綜上所述，我們克隆了屬于CLM家族的CLM3分子并對(duì)其的生物學(xué)特性及功能進(jìn)行了研究。CLM3主要在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中表達(dá)，能促進(jìn)CpG ODN刺激的腹腔巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌，免疫共沉淀證實(shí)CLM3通過(guò)與MyD88結(jié)合來(lái)促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且CL

16、M3增強(qiáng)了CpG ODN誘導(dǎo)的MAPK、NF-κB的活化。本課題探討了CLM3對(duì)TLR9通路的細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響并初步研究了其作用機(jī)制，為免疫識(shí)別以及抗感染治療提供了一條新的途徑。 綜上所述，我們對(duì)CLM家族的CLM5的生物學(xué)特性及功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CLM5主要在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中表達(dá)，干擾CLM5表達(dá)之后能夠降低TLRs配體刺激的腹腔巨噬細(xì)胞IFN-βand IL6的分泌，經(jīng)VSV刺激后IFN-β產(chǎn)生也降低。進(jìn)一步研究表明C