Toll樣受體信號(hào)對(duì)表皮黑素細(xì)胞天然免疫功能的影響和意義.pdf

1、白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的原發(fā)性的、獲得性的皮膚色素脫失性皮膚、粘膜疾病,以大小不等、數(shù)目不定的色素完全脫失斑為典型皮損。目前認(rèn)為其發(fā)病是多基因遺傳的、在多種內(nèi)外因子的激發(fā)下表現(xiàn)為免疫功能紊亂,導(dǎo)致表皮黑素細(xì)胞破壞,終至色素脫失。徹底闡明白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制特別是免疫機(jī)制對(duì)于探索到治療白癜風(fēng)的新靶點(diǎn)有著非常重要的意義。 在白癜風(fēng)中盡管存在自身免疫異常的證據(jù),但是導(dǎo)致針對(duì)黑素細(xì)胞自身抗原的細(xì)胞和體液免疫是如何觸發(fā)的問(wèn)題仍有待解決。根據(jù)Matz

2、inger的危險(xiǎn)信號(hào)學(xué)說(shuō),體內(nèi)的細(xì)胞損傷等危險(xiǎn)信號(hào)可激活A(yù)PC來(lái)活化適應(yīng)性免疫反應(yīng),在白癜風(fēng)自身免疫反應(yīng)的觸發(fā)期,往往存在皮膚黑素細(xì)胞生物學(xué)特性的異常,例如,外源性機(jī)械刺激、燒傷、過(guò)度紫外線照射以及化學(xué)物質(zhì)的刺激會(huì)導(dǎo)致局部黑素細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài),而這種應(yīng)激狀態(tài)是否導(dǎo)致黑素細(xì)胞的免疫學(xué)特性發(fā)生改變,從而激發(fā)或者放大隨之而來(lái)的針對(duì)黑素細(xì)胞抗原的適應(yīng)性自身免疫反應(yīng),還需要的研究證實(shí)。但是毋庸置疑的是黑素細(xì)胞的天然免疫特性可能在聯(lián)結(jié)黑素細(xì)胞應(yīng)激反

3、應(yīng)與自身免疫免疫反應(yīng)中起到了重要的橋梁作用。 近年來(lái)對(duì)黑素細(xì)胞的研究,特別是對(duì)其生物學(xué)特性及細(xì)胞生化方面的研究已經(jīng)較為深入,許多證據(jù)都表明黑素細(xì)胞與皮膚免疫系統(tǒng)之間有密切聯(lián)系。體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞表面可以表達(dá)MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、粘附分子ICAM-1、VCAM-1及Fc受體等免疫分子,并且能夠被IFN-γ和TNF-α上調(diào)表達(dá);黑素細(xì)胞自身還能分泌細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-8和TGF-β等細(xì)胞因子,認(rèn)為黑素細(xì)胞是皮膚免疫系統(tǒng)的

4、重要成員,并且可能以更加主動(dòng)的方式參與并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。TLRs被認(rèn)為只表達(dá)在免疫細(xì)胞和多種炎癥細(xì)胞表面,如樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)、巨噬細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞等,與其相應(yīng)的配體結(jié)合后可以激活免疫細(xì)胞使其分泌大量的促炎性細(xì)胞因子和趨化因子,參與活化天然免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答,構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的第一道防線。近年來(lái),有報(bào)道指出除免疫細(xì)胞外,多種組織細(xì)胞也表達(dá)TLRs,例如皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)不同的TLRs,與TLRs

5、相應(yīng)配體結(jié)合后被激活,分泌大量的細(xì)胞因子和趨化因子。由上述關(guān)于白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制和TLRs生物學(xué)功能的研究,我們?cè)O(shè)想:黑素細(xì)胞可以表達(dá)功能性TLRs,TLRs與其內(nèi)外源性配體結(jié)合后引發(fā)黑素細(xì)胞生物學(xué)及免疫學(xué)表型和功能的變化,這種變化很可能與白癜風(fēng)自身免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。盡管這種聯(lián)系存在著諸多疑問(wèn)。一旦這些疑問(wèn)得到解決,我們將發(fā)現(xiàn)一個(gè)新穎的角度解釋白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制,并有希望將該通路作為新的治療靶點(diǎn)應(yīng)用于白癜風(fēng)的臨床治療。

6、 第一部分 Toll樣受體在人表皮黑素細(xì)胞上的表達(dá) 一、正常人黑素細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代鑒定
　　原代培養(yǎng)細(xì)胞24 h后開(kāi)始貼壁,可見(jiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞間散在的多級(jí)樹(shù)突狀細(xì)胞,大部分細(xì)胞胞體圓而小,有兩個(gè)對(duì)稱(chēng)樹(shù)突,突起長(zhǎng)短不等;少數(shù)細(xì)胞胞體大,呈多角形,有2個(gè)至數(shù)個(gè)樹(shù)突。約14天后可傳代,根據(jù)角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞對(duì)胰酶的不同耐受性和成纖維細(xì)胞不能耐受G418的特性可分離出純黑素細(xì)胞。顯微鏡下可見(jiàn)系胞質(zhì)及樹(shù)突呈棕褐色或黑色,多巴染

7、色結(jié)果呈陽(yáng)性。我們采用RT-PCR法對(duì)體外培養(yǎng)的第三代黑素細(xì)胞進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,角質(zhì)形成細(xì)胞特異性標(biāo)記分子keratin 10和keratin 14,成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子ASO2均不能被擴(kuò)增,證明用上述培養(yǎng)傳代方法制備的第三代黑素細(xì)胞純度較好,可用于進(jìn)行下一步試驗(yàn)。 二、TLR3在黑素細(xì)胞上表達(dá)的鑒定
　　為了定性證明各TLRs成員在黑素細(xì)胞上的表達(dá),我們以體外培養(yǎng)的第三代黑素細(xì)胞為對(duì)象,并且以正常人外周血PBMC

8、作為陽(yáng)性對(duì)照,采用RT-PCR法檢測(cè)到mRNA水平表達(dá)的TLR1,2,3,4,6,7以及9,未檢測(cè)到TLR5,8和10。我們采用間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)在蛋白水平證明黑素細(xì)胞上TLR2,4,7和9的表達(dá)。為了揭示黑素細(xì)胞上表達(dá)的TLR3的亞細(xì)胞定位,我們采用間接免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)黑素細(xì)胞膜上和胞內(nèi)可能存在的TLR3進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果證實(shí):黑素細(xì)胞上表達(dá)的TLR3主要定位于細(xì)胞內(nèi)。
　　為了進(jìn)一步證實(shí)TLR3的表達(dá),我們用Wes

9、tern blot方法對(duì)TLR3進(jìn)行了免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果顯示:PVDF膜在TLR3的位置上出現(xiàn)了特異性的染色條帶,大小為100 kD左右,與文獻(xiàn)報(bào)道的人TLR3分子量相符合。為排除黑素細(xì)胞培養(yǎng)條件對(duì)TLR3表達(dá)的影響,我們采用熒光免疫組織化學(xué)法檢NTTLR3在皮膚組織中的原位表達(dá)。結(jié)果證實(shí),NKI/beteb作為特異性標(biāo)志顯示黑素細(xì)胞位于表皮真皮交界處,并可以觀察到黑素細(xì)胞上TLR3的表達(dá)。 三、Poly(I:C)對(duì)黑素細(xì)胞上T

10、LR3 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　上述結(jié)果顯示,人表皮黑素細(xì)胞可以組成性表達(dá)TLR3,因此接下來(lái)討論TLR3的表達(dá)是否可以被其特異性配體Poly(I:C)誘導(dǎo)。在不同濃度Poly(I:C)作用后6 h,TLR3 mRNA開(kāi)始上調(diào)表達(dá),其上調(diào)倍數(shù)分別為:2.7(1μg/ml),4.2(10μg/ml)以及3.6(100 μg/ml)。在Poly I:C作用24小時(shí)后,TLR3上調(diào)表達(dá)倍數(shù)分別為3.8(1μg/ml),13(10μg/m

11、l)以及37(100 μg/ml),并明顯劑量依賴性。這些結(jié)果證明TLR3可以被其配體刺激上調(diào)表達(dá),黑素細(xì)胞表達(dá)的TLR3具有一定生物學(xué)功能。 第二部分 黑素細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體的促炎性功能 一、TLR活化誘導(dǎo)黑素細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)。我們?cè)谇笆龉ぷ髦幸炎C明黑素細(xì)胞表達(dá)TLR家族的眾多成員,為了驗(yàn)證這些TLR是否也具有相應(yīng)的功能,首先,我們檢測(cè)了黑素細(xì)胞在TLR活化條件下促炎性細(xì)胞因子IL-8和IL-6的分泌情況。結(jié)果顯

12、示:針對(duì)TLR2,3,4,7和9的激活劑都可以誘導(dǎo)IL-8分泌量顯著提高,其中以TLR3激活劑poly(I:C)最強(qiáng)烈。黑素細(xì)胞在用PGN,poly(I:C),LPS以及CpG 2006刺激時(shí),IL-6分泌水平明顯升高,但在用imiquimod作為刺激物刺激黑素細(xì)胞上表達(dá)的TLR7時(shí),并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)IL-6分泌水平的變化。趨化因子在吸引免疫細(xì)胞浸潤(rùn)改變皮膚局部免疫格局中發(fā)揮重要作用。接下來(lái)我們采用real-time PCR法檢測(cè)了TLR活化

13、后趨化因子CCL2/MCP-1,CCL3/MIP-1和CCL5/RANTES。結(jié)果顯示,在不同TLR激活劑刺激下,黑素細(xì)胞分泌各種趨化因子格局各有不同。所有的TLR配體都可以顯著誘導(dǎo)CCL3 mRNA的表達(dá),同時(shí)CCL2和CCL5也有不同程度的表達(dá)增高,但TLR7配體imiquimod無(wú)此效應(yīng)。 二、TLR活化激活黑素細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路
　　在前面的結(jié)果中,我們證明了TLR活化可以誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放,接下

14、來(lái)我們將驗(yàn)證NF-κB信號(hào)通路的活化是否介導(dǎo)了TLR活化誘導(dǎo)黑素細(xì)胞炎性細(xì)胞因子和趨化因子的分泌。首先,我們用western blot檢測(cè)磷酸化IκBα水平。結(jié)果證實(shí):不同TLR配體處理黑素細(xì)胞后,磷酸化IκBα蛋白水平都有不同程度的升高。NF-κB活化后即發(fā)生核轉(zhuǎn)位,由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核。為了進(jìn)一步證實(shí)NF-κB信號(hào)通路的激活,我們應(yīng)用間接免疫熒光檢測(cè)胞質(zhì)及胞核內(nèi)NF-κBp65水平。結(jié)果證實(shí):未受刺激的黑素細(xì)胞,p65亞基幾乎只分布在胞

15、質(zhì)內(nèi),TLR不同配體刺激后,黑素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)p65蛋白明顯下降,而胞核內(nèi)p65蛋白則顯著上調(diào)。 第三部分 TLR3活化誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡 一、dsRNA誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡為觀察TLR3配體dsRNA對(duì)黑素細(xì)胞的影響,我們利用phalloidin熒光染料對(duì)細(xì)胞骨架蛋白actin進(jìn)行染色,結(jié)合相差顯微鏡觀察黑素細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用poly(I:C)作用于黑素細(xì)胞后,細(xì)胞形態(tài)由梭形或多角形變?yōu)楸馄叫?樹(shù)突逐漸消失。臺(tái)盼蘭拒染實(shí)

16、驗(yàn)顯示,隨著poly(I:C)劑量的增加,黑素細(xì)胞存活率逐漸降低,呈劑量依賴性。Hoechst 33258細(xì)胞核染色結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞核熒光呈淡藍(lán)色且著色較均一,而poly(I:C)作用后的黑素細(xì)胞核呈特征性亮藍(lán)色熒光,并可觀察到細(xì)胞核固縮及團(tuán)塊狀的凋亡小體。收集poly(I:C)作用的黑素細(xì)胞,抽取細(xì)胞總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組細(xì)胞基因組DNA相比,poly(I:C)作用的黑素細(xì)胞DNA呈明顯的ladder,

17、提示有凋亡細(xì)胞的存在。進(jìn)一步用Annexin-V/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黑素細(xì)胞凋亡情況,dsRNA作用后,顯示早期凋亡信號(hào)(Annexin V+/PI-)的黑素細(xì)胞數(shù)量(22％)明顯多于對(duì)照抗體組(2.5％),說(shuō)明dsRNA在可以在體外誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡。 二、dsRNA的促凋亡效應(yīng)由TLR3介導(dǎo)
　　我們通過(guò)前期的結(jié)果證實(shí)了dsRNA對(duì)黑素細(xì)胞的促凋亡作用,為了進(jìn)一步證實(shí)這種效應(yīng)由TLR3介導(dǎo),我們應(yīng)用慢病毒載體穩(wěn)

18、定表達(dá)針對(duì)TLR3的shRNA,抑制原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞中TLR3的表達(dá)。采用western blot法檢測(cè)TLR3蛋白水平的變化。結(jié)果顯示:通過(guò)慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shTLR3的黑素細(xì)胞,其TLR3表達(dá)水平顯著下降,而轉(zhuǎn)染隨機(jī)對(duì)照shRNA對(duì)TLR3表達(dá)水平并無(wú)影響。隨后我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下調(diào)TLR3表達(dá)的黑素細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了shTLR3的黑素細(xì)胞受到poly(I:C)刺激后,其凋亡率明顯降低,證明了TLR3介導(dǎo)了d

19、sRNA對(duì)黑素細(xì)胞的促凋亡效應(yīng)。 三、dsRNA的促凋亡效應(yīng)不依賴于NF-κB活化
　　為驗(yàn)證NF-κB通路的活化是否與dsRNA誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡有關(guān)我們進(jìn)而采用NF-κB特異性阻斷劑Bay11-7082作用于TLR3激活下的黑素細(xì)胞,用westernblot檢測(cè)磷酸化IκBα水平。結(jié)果顯示:TLR3活化后上調(diào)的磷酸化IκBα水平,Bay11-7082有一定的抑制作用,進(jìn)而檢測(cè)dsRNA對(duì)黑素細(xì)胞的促凋亡效應(yīng)。Bay11-

20、7082雖然能夠部分抑制NF-κB的活化,但對(duì)于dsRNA誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡卻沒(méi)有抑制作用,同時(shí)我們用TLR4的配體LPS刺激黑素細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)LPS不能明顯抑制黑素細(xì)胞凋亡。因?yàn)長(zhǎng)PS是已知的NF-κB強(qiáng)誘導(dǎo)劑,所以以上結(jié)果證實(shí),NF-κB通路并沒(méi)有參與TLR3活化誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡。
　　四、TLR3介導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡與IFN-β自分泌有關(guān)
　　TLR3活化誘導(dǎo)的干擾素釋放對(duì)于機(jī)體抗病毒反應(yīng)具有重要意義,同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道Ⅰ型干

21、擾素,包括IFN-α和IFN-β,在某些細(xì)胞中可以誘導(dǎo)凋亡途徑的激活,因此,在我們下一步研究中,我們分析了Ⅰ型干擾素在TLR3活化介導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡中的可能作用。我們用TLR3配體dsRNA刺激黑素細(xì)胞后,取培養(yǎng)上清,用ELISA法分別檢測(cè)Ⅰ型IFN即IFN-α和IFN-β的分泌。結(jié)果證實(shí),受到dsRNA刺激進(jìn)而TLR3活化之后,IFN-α和IFN-β的分泌水平顯著提高。用western blot方法檢測(cè)了TLR3活化后STATl磷酸化

22、的水平,結(jié)果顯示:dsRNA處理黑素細(xì)胞2小時(shí)后,磷酸化STAT1水平顯著升高。
　　為了進(jìn)一步確證Ⅰ型IFN與黑素細(xì)胞凋亡的關(guān)系,我們使用特異性識(shí)別IFN-α和IFN-β的中和性抗體分別作用于黑素細(xì)胞,并用dsRNA刺激TLR3活化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):IFN-β中和性抗體能夠強(qiáng)烈抑制poly(I:C)誘導(dǎo)下的黑素細(xì)胞凋亡,而IFN-α中和性抗體沒(méi)有此效應(yīng)。 為了進(jìn)一步證明IFN-β分泌與黑素細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系,我們運(yùn)用不同濃度I

23、FN-β中和性抗體作用于黑素細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著使用的抗體濃度增高,其抑制黑素細(xì)胞凋亡的效應(yīng)也不斷增強(qiáng)。
　　以上結(jié)果證明了黑素細(xì)胞自分泌的IFN-β在TLR3活化誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡中的作用,進(jìn)一步,我們分析了外源性加入的IFN-α或IFN-β是否能直接影響黑素細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示:外源性加入的IFN-α、IFN-β沒(méi)有顯著影響黑素細(xì)胞的生存率。以上結(jié)果證明,IFN-β參與TTLR3活化誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡,但I(xiàn)FN-β本身不能直接誘

24、導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡。 五、p38 MAPK和ERK1/2參與了TLR3介導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡 細(xì)胞的凋亡在體內(nèi)受到多條信號(hào)通路的影響,已報(bào)道在TLR活化中,MAPK途徑發(fā)揮重要作用,所以在下一步的研究中我們將分析MAPK成員p38,ERK1/2和JNK1/2在dsRNA的促I(mǎi)FN-β分泌以及凋亡效應(yīng)中的作用。我們用poly(I:C)與黑素細(xì)胞共孵育后,采用western blot檢測(cè)p38,ERK1/2和JNK1/2的磷酸化情況

25、。結(jié)果顯示:poly(I:C)作用后,磷酸化p38、磷酸化ERK1/2和磷酸化JNK1/2水平都有不同程度上調(diào)。 為了證明活化的p38,ERK1/2和JNK1/2,是直接與dsRNA的促凋亡效應(yīng)相關(guān),還是僅為T(mén)LR3活化的伴隨效應(yīng),我們采用特異性的阻斷劑對(duì)p38,ERK1/2以及JNK1/2信號(hào)通路分別進(jìn)行了阻斷后,檢測(cè)TLR3活化對(duì)黑素細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示:用p38特異性阻斷劑SB203580與poly(I:C)N時(shí)作用后

26、,黑素細(xì)胞凋亡率下降了73.6％,用ERK1/2特異性阻斷劑U0126作用后,黑素細(xì)胞凋亡率下降了50％,而用JNK1/2阻斷劑SP600125作用后,不影響黑素細(xì)胞的凋亡率,以上結(jié)果證明,在TLR3活化誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡過(guò)程中,p38和ERK1/2通路可能發(fā)揮一定的作用。
　　為了進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)果,我們將p38、ERK1/2以及JNK1/2通路阻斷后,在形態(tài)學(xué)上觀察TLR3活化對(duì)黑素細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果證實(shí):對(duì)p38和ERK1

27、/2的阻斷可以部分逆轉(zhuǎn)TLR3活化導(dǎo)致的黑素細(xì)胞凋亡,而阻斷JNK1/2途徑無(wú)此效應(yīng)。阻斷p38和ERK1/2都可以顯著抑制poly(I:C)刺激下的IFN-β釋放,阻斷JNK1/2無(wú)明顯作用。以上結(jié)果證實(shí),p38和ERK1/2通路參與了TLR3活化介導(dǎo)的IFN-β分泌與黑素細(xì)胞凋亡。 綜上所述,本課題證實(shí)人表皮黑素細(xì)胞在mRNA水平蛋白水平組成性表達(dá)TLR2,3,4,7和9的表達(dá)。這些TLR受其特異性配體刺激后,黑素細(xì)胞合成表

28、達(dá)促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的水平升高。我們發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞表達(dá)的TLR3活化后可以誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡,這種凋亡效應(yīng)依賴于IFN-β的自分泌,并受信號(hào)通路p38和ERK1/2的影響?；谝陨辖Y(jié)果,我們推測(cè)黑素細(xì)胞表達(dá)的TLR3很可能與白癜風(fēng)自身免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。黑素細(xì)胞可以通過(guò)表達(dá)TLR3直接識(shí)別病毒代謝中產(chǎn)物dsRNA或壞死細(xì)胞釋放的dsRNA,從而改變了黑素細(xì)胞的免疫學(xué)表性和生物學(xué)功能,激發(fā)或放大針對(duì)黑素細(xì)胞自身抗原的免疫