模式識別受體觸發(fā)的巨噬細胞天然免疫應答調控的新機制研究.pdf

1、第一部分 microRNA-92a通過靶向MKK4負向調節(jié)TLR誘導的巨噬細胞炎癥反應
　　天然免疫是機體防御病原體入侵的第一道有效防線，病毒、細菌等致病性病原微生物一旦入侵機體，將迅速啟動機體的天然免疫應答，觸發(fā)炎癥反應。在天然免疫細胞如巨噬細胞，樹突狀細胞等對病原微生物的識別過程中，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為一種模式識別受體發(fā)揮著重要作用。TLRs特異性識別病原體中特定的分子結構，激

2、活其下游的MyD88或TRIF依賴的信號通路，激活MAPK、NF-κB或者IRF3信號，最終激活天然免疫細胞產生炎癥細胞因子和Ⅰ型干擾素，構成機體免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵的第一道屏障。MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的長度約為21～23個bp的非編碼寡聚核苷酸，其功能主要是通過與mRNA的3'非編碼區(qū)(3'UTR)特異靶位點相互作用從而負向調控mRNA的翻譯。miRNA參與調控了多種生物學過程，如生長、發(fā)育、分化、

3、腫瘤的發(fā)生等。同樣，miRNA對免疫應答和免疫細胞的分化和功能也起著十分重要的調控作用。已有多篇關于miRNA參與調控天然免疫應答的相關報道，如miRNA-146、miRNA-101分別在炎癥反應中起著負向和正向的調控作用。
　　miRNA-92a已被報道在腫瘤和血管生成方面起著重要作用，但其在天然免疫中的作用和意義未見報道。我們發(fā)現(xiàn)用多種TLR配體，如TLR2、TLR3、TLR4的配體LPS，PGN，PolyI∶C分別刺激小鼠原

4、代腹腔巨噬細胞后， miR-92a的表達水平在短時間內下降。我們進一步檢測了miR-92a在MyD88或TRIF缺失的巨噬細胞中經TLR配體刺激后的表達變化，發(fā)現(xiàn)miR-92a的表達下降同時由TLR信號途徑中的MyD88，TRIF通路所誘導。之后，我們將合成的siRNA轉染到巨噬細胞中，來模擬內源性miR-92a的功能或特異性抑制其作用來進一步研究miR-92a的功能。研究發(fā)現(xiàn)miR-92a的過表達可明顯降低LPS誘導的炎癥因子TNF-

5、α和IL-6mRNA和蛋白表達水平，同時減低了JNK和C-JUN的磷酸化水平。相反地，抑制miR-92a功能后，巨噬細胞TNF-a和IL-6的表達增加，JNK/C-JUN信號通路增強。由于miRNA主要通過調控靶基因的表達進而發(fā)揮生物學功能，我們進一步通過miRNA靶點預測網站來尋找潛在的使miR-92a發(fā)揮上述功能的靶點分子。熒光素酶報告基因和蛋白檢測等實驗結果表明miR-92a可直接靶向抑制MKK4的表達，而MKK4是TLR信號中促

6、進JNK活化的關鍵中間信號分子。接著，我們進一步證實了MKK4的功能，干擾MKK4后，JNK/C-JUN信號通路減弱，繼而降低炎癥因子TNF-α和IL-6的表達和分泌。
　　綜上所述，miR-92a在巨噬細胞TLR配體誘導的炎癥反應中，可通過靶向抑制MKK4，從而降低JNK/C-JUN信號通路的活化，最終抑制炎癥因子的表達。該研究結果為巨噬細胞炎癥應答的調控機制增添了新的認識，并可能為炎癥引起的免疫相關性疾病的診治提供新的靶標。<

7、br>　　第二部分 microRNA-33通過靶向ABCA1和ABCG1促進TLR誘導的巨噬細胞炎癥反應
　　TLRs(Toll-like receptors)是一類重要的病原分子模式PAMPs識別受體，在天然細胞如巨噬細胞，樹突狀細胞中廣泛表達。TLRs特異性識別病原體中特定的分子結構，激活其下游的MyD88或TRIF依賴的信號通路，激活MAPK、NF-κB或者IRF3信號，最終激活天然免疫細胞產生炎癥細胞因子和Ⅰ型干擾素。mi

8、croRNAs(miRNAs)是一種進化上保守的長約21～23個核苷酸的非編碼RNA，其通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)間結合在轉錄后水平抑制靶基因表達。miRNA在生物體內發(fā)揮著重要的調控機制同樣，同樣對免疫應答和免疫細胞的分化和功能也起著十分重要的調控作用。
　　由于在脂類代謝方面的關鍵作用，miR-33最近幾年受到了研究者的廣泛關注，但其在天然免疫中的作用和意義尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)用多種TLR配體，如TLR2、TLR3、TLR4的配

9、體HKLM，LPS，PolyI∶C分別刺激小鼠原代腹腔巨噬細胞后，miR-33的表達水平在刺激后期下降。我們進一步檢測了miR-33在MyD88或TRIF缺失的巨噬細胞中經TLR配體刺激后的表達變化，發(fā)現(xiàn)miR-33的表達下降主要受到TLR信號途徑中的TRIF通路所調控。之后，我們將合成的siRNA轉染到巨噬細胞中，來模擬內源性miR-33的功能或特異性抑制其作用來作進一步的研究。研究發(fā)現(xiàn)miR-33的過表達可明顯增加LPS誘導的炎癥因

10、子TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白表達水平。相反地，抑制miR-33后，巨噬細胞TNF-α和IL-6的表達下降。膽固醇轉運蛋白ABCA1和ABCG1被報道是miR-33的直接靶點，且其在炎癥反應中起著負向調控的作用。由此，我們猜測miR-33可通過靶基因ABCA1和ABCG1對炎癥起到調控作用。為此，我們首先驗證了在原代巨噬細胞中，miR-33可直接作用于ABCA1和ABCG1，使其mRNA和蛋白水平下降。ABCA1-/-，ABCG

11、1-/-小鼠來源的巨噬細胞中，過表達miR-33對炎癥因子的正向調控作用減弱。同時，巨噬細胞內ABCA1和ABCG1的表達增加也減弱了miR-33對炎癥因子的正向調控作用。接著，我們進一步研究了miR-33調控TLR觸發(fā)的炎癥應答的機制。ABCA1和ABCG1協(xié)同負責轉運細胞內的膽固醇到細胞外，從而降低細胞膜內游離膽固醇的含量，進而影響脂筏的含量，抑制TLR信號的轉導。因此，我們檢測了miR-33對細胞膜脂筏含量的影響，結果發(fā)現(xiàn)miR-

12、33可增加細胞膜內的脂筏含量，從而增強TLR信號，主要是NF-κB信號，最終促進炎癥因子TNF-a和IL-6的表達和分泌。脂筏結構干擾化合物處理細胞后，miR-33對炎癥因子的調控作用減弱，進一步驗證了miR-33可通過調節(jié)細胞膜脂筏的含量來調控TLR觸發(fā)的炎癥應答。另一方面，miR-33也可抑制抗炎因子IL-10的表達，協(xié)同促進炎癥因子的表達。
　　綜上所述，在巨噬細胞中，可能存在以下調控網絡:LPS刺激后，TRIF信號通路可降

13、低miR-33的表達，miR-33的下降釋放了對靶基因ABCA1和ABCG1的抑制，從而促進細胞內游離膽固醇的外流，膜內脂筏含量降低，TLR信號減弱。另一方面，miR-33下降后，抗炎因子IL-10的表達增加，兩者協(xié)同抑制炎癥因子的表達。本課題的研究結果為巨噬細胞炎癥應答的調控機制增添了新的認識，提示了膽固醇與炎癥之間存在的關系，為炎癥引起的免疫相關性疾病的診治提供新的思路。
　　第三部分IL-9對PAMPs誘導的巨噬細胞炎癥反應

14、的調控作用以及機制研究
　　Interleukin9(IL-9)起初最為一種T細胞和肥大細胞的生長因子被研究者所認識。近十幾年的研究揭示了IL-9更多的生物學功能以及產生機制，引起了研究者的廣泛關注。初始CD4+T細胞在體外TGF-β和IL-4培養(yǎng)下能高分泌IL-9，分化成Th9細胞。
　　IL-9通過與IL-9受體結合發(fā)揮其生物學活性。IL-9能促進T細胞和肥大生長之外，對B細胞、固有淋巴細胞、單核細胞等的生長和功能也具有

15、調控作用。IL-9能夠促進LPS誘導激活的人巨噬細胞和單核細胞分泌TGF-β，并降低TNF-α的表達，從而抑制突發(fā)性氧化作用。IL-9也能抑制APC誘導的Th1型免疫應答。
　　IL-9在各類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不同的作用。在超敏反應和自身免疫性病中，IL-9作為一種炎癥分子，能加速疾病的發(fā)展;而在寄生蟲感染和皮膚移植中，IL-9能促進機體清除病原體以及移植物免疫耐受的形成。巨噬細胞作為炎癥應答的主要細胞，在病原體感染和炎癥反應

16、中起著關鍵的作用。病原菌都有一些保守的特征性分子，稱為病原菌相關分子模式PAMPs(pathogen-associated molecularpatterns)。細胞表面的模式識別受體PRRs通過識別病原菌的PAMPs而激發(fā)免疫反應。一旦識別了病原體，PRRs就會激活其下游一系列的信號通路，活化天然免疫細胞產生炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素等細胞因子，從而啟動天然免疫應答。而目前，IL-9對PAMPs誘導的巨噬細胞炎癥應答的調控作用尚未清楚。

17、因此，本研究的目的主要在于了解IL-9是否參與該過程，從而進一步了解IL-9在炎癥疾病中作用。
　　利用IL-9基因敲除小鼠，我們發(fā)現(xiàn)，IL-9-/-小鼠骨髓來源的巨噬細胞在各類PAMPs刺激下，炎癥因子TNF-α，IL-6，IL-1β的表達顯著下降。之后，我們單獨用IL-9處理原代巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)高濃度的IL-9能誘導原代巨噬細胞產生IL-6，TNF-α。同時，用低濃度的IL-9處理能夠增強原代巨噬細胞對PAMPs誘導的炎癥因子的