人白細胞介素15 cDNA協(xié)同優(yōu)化的人乳頭瘤病毒16型E7核酸疫苗治療宮頸癌的初步研究.pdf

1、宮頸癌是婦女因惡性腫瘤而死亡的第二位死因，是威脅婦女健康的大敵。高危型人乳頭瘤病毒(HPV)，尤其是HPV 16型是宮頸癌的主要致病因子，99％以上的宮頸癌病例都可檢測到HPV感染。晚期宮頸癌的治療除了手術(shù)放化療以外尚無良策。那么針對宮頸癌的病因——HPV感染來研制預(yù)防和治療宮頸癌的疫苗來戰(zhàn)勝宮頸癌已成為人們的普遍共識，并已取得了一定成果。其中治療性疫苗多選用HPV的兩個早期基因E6和E7基因作為抗原基因。這兩個基因的表達產(chǎn)物是引起細胞

2、惡性轉(zhuǎn)化的主要癌蛋白。疫苗的形式多種多樣，包括微生物載體疫苗，蛋白疫苗，DNA疫苗等。大多數(shù)疫苗在動物實驗中都取得了較好的抗瘤效果，部分已進入臨床實驗。但目前得到的臨床實驗的結(jié)果并不盡如人意。所以提高治療性疫苗的免疫原性從而增強疫苗的免疫效果十分必要。 本研究是關(guān)于宮頸癌治療性疫苗的研究。研究選用了DNA疫苗這一形式，采用HPV16 E7基因作為抗原靶基因，從增強疫苗免疫原性并消除抗原蛋白轉(zhuǎn)化活性這一角度出發(fā)，對抗原基因進行了一

3、系列優(yōu)化，并將優(yōu)化后的基因與結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白70(MtHSP70)基因相融合作為宮頸癌治療性疫苗的主體，為了增強免疫效果，還選用人白細胞介素15(hIL-15)基因作為分子佐劑協(xié)同免疫。研究首先構(gòu)建了一系列重組真核表達質(zhì)粒，使用Western blot，免疫熒光以及ELISA方法驗證了這些質(zhì)粒的體外表達后，對動物進行了分組免疫，并對該疫苗激發(fā)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的可能機制進行了探討。具體的疫苗優(yōu)化策略和實驗結(jié)果如下： 1．對H

4、PVl6 E7基因進行系列優(yōu)化。首先對E7基因進行g(shù)ene shuffle，即基因切割重排。將E7基因分成a,b,c三個部分，將中間部分b重復(fù)一次，得到abbc序列，并在該序列的兩端各添加一個HLA*A0201表位，得到重排的HPV16 E7基因(SHE7)。基因重排后，用哺乳動物偏愛的密碼子對HPV16 ShE7病毒基因進行優(yōu)化，并突變了與轉(zhuǎn)化活性相關(guān)的Rb位點和鋅指結(jié)合區(qū)，期望通過這樣的優(yōu)化策略來提高表位劑量，增加蛋白表達量并消除抗

5、原蛋白的轉(zhuǎn)化活性?；騼?yōu)化后，采用人工合成的方法合成了HPV16 E7基因。 2．選用VR1012作為疫苗的真核表達載體，將優(yōu)化的HPV16 ShE7與MtHSP70基因相融合，構(gòu)建了以HPV16 ShE7/MtHSP70融合基因為主體的DNA疫苗VR1012-HPV16 ShE7/MtHSP70，同時構(gòu)建了野生型HPV16 E7基因，單獨HPV16 ShE7基因和MtHSP70基因的真核表達質(zhì)粒-VR1012-WE7，VR10

6、12-ShE7，VR1012-MtHSP70。另外還構(gòu)建了兩個人IL-15的真核表達質(zhì)粒-VR1012-hIL-15和VR1012-hIL-2S/hI1-15。將上述重組質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞，通過Western blot和免疫熒光的方法鑒定了WE7，ShE7，ShE7/MtHSP70以及Mt HSP70蛋白在細胞中的表達與定位，通過ELISA的方法鑒定了IL-15在細胞中的分泌性表達。 3．選用PGEX-4T1作為原核

7、表達載體，構(gòu)建了HPV16 E7基因的原核表達載體，在E.Coli(BL21/DE3)中表達了GST-E7融合蛋白并使用親和層析的方法對該蛋白進行了純化。該蛋白擬用于檢測疫苗免疫后產(chǎn)生的特異性E7抗體，根據(jù)凝膠薄層掃描結(jié)果顯示，蛋白純度達到75％以上，可以滿足體外免疫檢測實驗的要求。 4．用上述構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒對小鼠進行了免疫。 將6-8周齡C57BL/6小鼠隨機分為六組：WE7免疫組，ShE7免疫組，ShE7/MtH

8、SP70免疫組，ShE7/MtHSP70+hIL-15免疫組，hlL-15免疫組和空載體VR1012對照組。雙側(cè)股四頭肌注射接種三次，肌肉注射后進行體內(nèi)電穿孔以增強基因轉(zhuǎn)染效率。在’WE7免疫組內(nèi)增加2只小鼠未進行體內(nèi)電穿孔，用于比較體內(nèi)電穿孔的效果。每次每種質(zhì)粒接種100μg，間隔2周。 作為宮頸癌治療性疫苗的研究，免疫原性的檢測，體內(nèi)抗瘤實驗以及抗瘤免疫機制的深入研究十分必要。本研究所作的工作為后續(xù)進一步深入研究人IL-15