人乳頭瘤病毒致宮頸癌的型別特異性差異的研究.pdf

1、在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是女性第二大常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年有527，624個(gè)新發(fā)病例和265，653個(gè)死亡病例(www.hpvcentre.net in Oct31th，2014)，其中85％的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。宮頸癌病因明確，大量的研究表明高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變的主要致病因素。HPV分高危型和低危型，高危型包括:HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV5

2、2、HPV56、HPV58、HPV61等。研究表明，HR-HPV表達(dá)的病毒癌基因E6和E7，可分別結(jié)合降解宿主細(xì)胞P53和Rb，引起細(xì)胞周期、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為改變，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生與進(jìn)展。但對(duì)不同型別的病毒癌蛋白之間是否存在差異尚不清楚。流行病學(xué)證據(jù)顯示，各種型別HPV在細(xì)胞學(xué)正常婦女和不同宮頸病變患者中的感染頻率并不相同，反應(yīng)了不同型別病毒感染力和致病力的不同，但是否與宿主對(duì)HPV型別特異的易感性有關(guān)

3、所知甚少。
　　本研究從不同型別HPV致宮頸癌能力差異和不同型別HPV感染宿主是否與宿主易感性有關(guān)兩方面進(jìn)行研究，首先通過(guò)設(shè)計(jì)兩條HPV58 E6特異性多肽片斷，將多肽交聯(lián)至三種不同載體蛋白，免疫兔子，獲得特異性HPV58 E6兔單克隆抗體。其次，通過(guò)構(gòu)建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16 E6/E7真核生物表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T和U2OS細(xì)胞，觀察HPV58E6/E7和HPV16

4、E6/E7基因?qū)?xì)胞的周期、凋亡、侵襲能力的差異及下游分子的表達(dá)差異，比較兩者致癌能力的差異。最后，收集3299例宮頸脫落細(xì)胞樣本，選出875例單純HPV16，18，52，58陽(yáng)性和HPV陰性，提取DNA，通過(guò)Illumina BeadXpress VeraCode platformSNP分型檢測(cè)技術(shù)，對(duì)HPV感染相關(guān)受體基因(EGFR，PPIB，HSPG2，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)URIN，ITGA6，TSPAN1和SDC2)上的96個(gè)tagS

5、NP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分析目的基因SNP與型別特異HPV感染和宮頸病變進(jìn)展的相關(guān)性。
　　本研究首次成功獲得了HPV58E6單克隆抗體;在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了相比HPV58E6/E7，HPV16E6/E7具有更強(qiáng)的促細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞侵襲的能力，進(jìn)一步揭示了E6-P53和E7-pRB在HPV致癌過(guò)程中所起的關(guān)鍵作用;還發(fā)現(xiàn)了與HPV型別特異性感染及其致宮頸病變進(jìn)展相關(guān)的差異宿主SNP位點(diǎn)，基因型及單倍型。本研究初步闡述了

6、HPV在自然界的分布規(guī)律和不同病變中分布特征的相關(guān)機(jī)制，更好地了解了HPV的致癌中的型別特異性差異，為制定有針對(duì)性的宮頸癌防控策略提供了科學(xué)證據(jù)。
　　第一部分 HPV58E6兔單克隆抗體的制備
　　目的:
　　研發(fā)HPV58E6特異性兔單克隆抗體，為進(jìn)一步體外研究HPV58E6提供基礎(chǔ)。
　　方法:
　　通過(guò)將HPV58E6序列與HPV16E6，HPV31E6，HPV33E6，HPV52E6，HPV67E

7、6等同源性較高的序列進(jìn)行比對(duì)，找出HPV58E6的特異性序列，針對(duì)該特異性序列設(shè)計(jì)兩條HPV58E6多肽片斷，將其交聯(lián)至三種不同載體蛋白，免疫新西蘭大白兔，獲得免疫血清，取血清篩選出抗體陽(yáng)性的大白兔并做ELISA確定滴度，分離篩選出的大白兔脾細(xì)胞并與融合伴侶細(xì)胞240E-W2進(jìn)行細(xì)胞融合，之后鋪板到96孔培養(yǎng)板，在1640AB培養(yǎng)基中進(jìn)行克隆培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA篩選，找到表達(dá)HPV58E6特異性抗體的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，針對(duì)陽(yáng)性克隆

8、，提取細(xì)胞RNA，用引物F1/R1進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到多個(gè)重鏈cDNA和多個(gè)輕鏈cDNA;將cDNA分別構(gòu)建到pTT5質(zhì)粒表達(dá)載體中，將包含重鏈cDNA的pTT5質(zhì)粒與包含輕鏈cDNA的pTT5質(zhì)粒進(jìn)行兩兩配對(duì)，共轉(zhuǎn)染到HEK-293-6E細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng);取細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，進(jìn)行ELISA檢測(cè);篩選IgG濃度最高且滴度OD值大于0.3的配對(duì)，即為HPV58E6特異性兔單克隆抗體的重鏈和輕鏈配對(duì)。制備重組抗體并進(jìn)行測(cè)序分析，從而

9、獲得特異性HPV58E6兔單克隆抗體。
　　結(jié)果:
　　1.設(shè)計(jì)的特異性HPV58E6多肽片段免疫新西蘭大白兔后獲得的血清能夠結(jié)合pEGFP-C1-HPV58E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所提取的蛋白。
　　2.雜交瘤細(xì)胞上清在pEGFP-C1-HPV16E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)條帶，而在pEGFP-C1-HPV58E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)條帶。
　　3.重組抗體ZJM1B-9在pEGFP-C1-HPV16E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)條帶，

10、而在pEGFP-C1-HPV58E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)條帶。
　　結(jié)論:
　　1.采用雜交瘤技術(shù)可以成功獲得抗HPV58E6兔單克隆抗體。
　　2.獲得的抗HPV58E6兔單克隆抗體可以特異性結(jié)合HPV58E6蛋白，而不能結(jié)合HPV16E6蛋白。
　　第二部分:HPV58與HPV16 E6/E7致宮頸癌功能差異的研究
　　目的:
　　明確HPV16與HPV58癌基因E6/E7在細(xì)胞表型方面的差異，及E6-

11、P53和E7-pRB的表達(dá)和定位的區(qū)別，從細(xì)胞表型和分子水平闡述兩種病毒致癌能力的差異。
　　方法:
　　通過(guò)構(gòu)建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16E6/E7真核生物表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T和U2OS細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，免疫熒光共聚焦拍攝細(xì)胞E6-P53和E7-pRB的共表達(dá)和共定位，比較HPV5

12、8E6/E7和HPV16E6/E7基因?qū)?xì)胞周期、凋亡、侵襲能力的差異及下游分子的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1.在293T和U2OS細(xì)胞中，相比陰性對(duì)照組，HPV58E6/E7過(guò)表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖;相比HPV58E6/E7，HPV16E6/E7過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)。
　　2.在293T細(xì)胞中，HPV58E6/E7組細(xì)胞周期S期比例分別為42.68％和45.39％，而HPV16E6/E7組細(xì)胞周期S期比例分別52

13、.66％和49.18％。在U2OS細(xì)胞中，HPV58E6/E7組細(xì)胞周期S期比例分別為32.73％和27.03％，而HPV16E6/E7組細(xì)胞周期S期比例分別37.32％和36.24％。
　　3.在293T細(xì)胞中，HPV58E6/E7組細(xì)胞早期凋亡比例分別為9.66％和12.1％，而HPV16E6/E7組細(xì)胞早期凋亡比例分別為6.6％和14.0％。在U2OS細(xì)胞中，HPV58E6/E7組細(xì)胞早期凋亡比例分別為5.63％和5.22％

14、，而HPV16E6/E7組細(xì)胞早期凋亡比例分別為3.84和3.44％。
　　4.在293T和U2OS細(xì)胞中，相比陰性對(duì)照組，HPV58E6/E7組細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng);相比HPV58E6/E7，HPV16E6/E7組細(xì)胞侵襲能力更強(qiáng)。
　　5.在293T和U2OS細(xì)胞中，相比HPV58E6組，HPV16E6組P53下降更顯著，且胞核內(nèi)表達(dá)更低;同時(shí)相比HPV58E7組，HPV16E7組pRB表達(dá)增多，且在核內(nèi)表達(dá)更多。
　

15、　結(jié)論:
　　與HPV58 E6/E7相比，HPV16 E6/E7顯示了更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力和降解P53和pRB能力，提示HPV16比HPV58具有更強(qiáng)的致癌力。
　　第三部分:HPV相關(guān)受體基因變異與型別特異宮頸感染和病變進(jìn)展的相關(guān)性研究
　　目的:
　　明確不同個(gè)體之間的HPV感染相關(guān)受體是否存在型別特異的與宮頸感染和病變進(jìn)展的相關(guān)的單核甘酸多態(tài)性(single nucleo

16、tide polymorphisms，SNPs)。
　　方法:
　　在3299例宮頸脫落細(xì)胞樣本中，挑選出單一HPV16，18，52，58陽(yáng)性和HPV陰性，共875例，提取DNA，通過(guò)Illumina BeadXpress VeraCode platform SNP分型檢測(cè)技術(shù)，對(duì)HPV感染相關(guān)受體基因（EGFR，PPIB，HSPG2，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)URIN，ITGA6，TSPAN1和SDC2）上的96個(gè)tagSNP位點(diǎn)進(jìn)行

17、檢測(cè)，分析目的基因SNP與型別特異HPV感染和宮頸病變進(jìn)展的相關(guān)性。在對(duì)照組中檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡。運(yùn)用Haploview，SPSS16.0，PLINK等軟件分析SNP結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　對(duì)病毒型別特異性感染的易感性分析顯示，HPV16有2個(gè)SNP(rs28384376，rs12034979)顯著相關(guān)和3個(gè)單倍型（“GGAA”，“GGGG”和“GA”）臨界相關(guān)，HPV18有4個(gè)SNP(rs2575738，

18、rs6697265，rs2575712，rs2575735)和3個(gè)單倍型(“GGG”，“GGA”和“GGAGA”)顯著相關(guān)，HPV52有2個(gè)SNP(rs10510097，rs12718946)和2個(gè)單倍型（“GGGAA”和“GGA”）顯著相關(guān)，HPV58有3個(gè)SNP(rs4947972，rs2981451，rs2575735)和2個(gè)單倍型（“GC”和“GA”）顯著相關(guān)。
　　對(duì)病毒型別特異性宮頸病變進(jìn)展的易感性分析顯示，HPV16

19、有5個(gè)SNP(rs3135772，rs2556537，rs12034979，rs1047057，rs16894821)和1個(gè)單倍型(“GG”)顯著相關(guān)，HPV18有3個(gè)SNP(rs6697265，rs6680566，rs16860426)和1個(gè)單倍型(“GG”)顯著相關(guān)，HPV52有3個(gè)SNP(rs878949，rs12718946，rs12668175)和1個(gè)單倍型(“CAA”)顯著相關(guān)，HPV58未見(jiàn)有顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)和單倍型。