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文檔簡介
1、1.研究背景:
大腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,除少數(shù)患者能早期發(fā)現(xiàn)并進行手術(shù)根治切除外,大部分中晚期患者均需要化療。當(dāng)前臨床上最常用的化療方案如奧沙利鉑(OXA)加5-氟尿嘧啶(5-FU)的FOLFOX方案治療轉(zhuǎn)移性晚期大腸癌緩解率為31~56%,中位生存期約為2年。但是,大部分腫瘤化療后最終會產(chǎn)生耐藥,重新進展,表明化療藥物并不能完全有效的殺滅所有腫瘤細胞,因此有效識別并清除這些殘留的腫瘤細胞是根治大腸癌的關(guān)鍵。
2、r> 近年的研究結(jié)果證實,腫瘤是一群異質(zhì)性很強的細胞組成,其中腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells,CSCs)是腫瘤形成的始發(fā)細胞。CSCs類似正常干細胞具有數(shù)目少、通常處于靜止?fàn)顟B(tài)、及自我更新能力等特點。目前已分別在白血病及實體腫瘤如腦、肺、乳腺、胰腺、大腸、肝臟等惡性腫瘤中成功分離出CSCs;而且發(fā)現(xiàn)CSCs表達相對特異的標(biāo)志物,同時表達兩個或兩個以上的標(biāo)志物較單一表達具有更強的干性;還證明這些CSCs對常規(guī)化療藥物
3、耐藥,易在化療后出現(xiàn)明顯富集,導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移,是化療藥物治療失敗的主要原因。
有研究顯示多數(shù)腫瘤干細胞包括大腸癌干細胞對化療藥物耐藥與其高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族、高效的DNA修復(fù)和抗凋亡特性等多種機制有關(guān)。ABC轉(zhuǎn)運蛋白是一類包括ABCB1、ABCC1、ABCG2等成員的ATP依賴型外排泵,通過將有害物質(zhì)(包括細胞毒藥物)排出細胞外、降低其胞內(nèi)濃度達到保護自身作用,而許多大腸癌臨床標(biāo)準(zhǔn)化療藥物都需通過作用在細胞核中
4、的DNA或相關(guān)的酶而發(fā)揮細胞毒性。另外,某些已證實具有抗腫瘤(干)細胞作用的天然產(chǎn)物如姜黃素,盡管有較強的體外抗腫瘤特性,但由于其高疏水性、體外不穩(wěn)定性及較差的藥代動力學(xué),極大地阻礙了該產(chǎn)物在體內(nèi)的療效,因此,針對目前大腸癌治療中遇到的困境,如何彌補現(xiàn)有藥物的相關(guān)缺陷,從而有效地殺傷CSCs,是當(dāng)前抗腫瘤藥物研究的難點。
納米藥物輸送系統(tǒng)的研發(fā)是納米醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要方向,也為解決上述這些難題提供了新手段,更為藥效佳但毒性大或
5、水溶性差的活性藥物提供可能。聚合物納米膠束兩親性的接枝或嵌段共聚物,通過自聚集,形成具有核-殼結(jié)構(gòu),為抗腫瘤藥物的輸送至相關(guān)作用靶點提供了有效的載體,而且,聚合物納米膠束可通過“增強滲透與保留作用”(EPR效應(yīng))將藥物積累在腫瘤組織中。其中硬脂酸-殼寡糖(CSO-SA)膠束由于其組織相容性和可代謝性,已被廣泛地用作聚合物藥物載體。CSO來源于脫乙酰殼多糖的酶降解,是無毒,低免疫原性和生物可降解性的。SA也是細胞毒性很低,因為它主要是脂肪
6、分子組成。已有研究表明,CSO-SA膠束用來作為荷載抗癌藥物的載體具有促進腫瘤細胞攝取作用,經(jīng)過表面基團的修飾,可作為亞細胞靶向載體將藥物輸送至細胞漿或細胞核,甚至特定細胞器中。前期工作已證明CSO-SA載藥膠束具有良好的體內(nèi)抑瘤效果和逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥(MDR)作用。
因此,如何有效的利用現(xiàn)行已經(jīng)證實具有抗腫瘤的活性藥物如化療代表藥奧沙利鉑和中藥單體姜黃素為模型,通過新型的CSO-SA納米藥物輸送系統(tǒng)來提高腫瘤細胞內(nèi)藥
7、物濃度,從而有效的殺滅腫瘤干細胞,降低藥物毒副作用,最終達到增強抗腫瘤效果,是具有應(yīng)用前景的新研究領(lǐng)域,有待深入探索。
2.研究目的:
本課題組與胡富強教授實驗室合作(浙江大學(xué)藥學(xué)院),整合了前期工作中已經(jīng)建立的較為穩(wěn)定成熟的殼寡糖硬脂酸納米膠束(CSO-SA)靶向藥物輸送技術(shù)以及大腸癌干細胞研究平臺。研究利用了CSO-SA膠束具有獨特的疏水性內(nèi)核-親水性外殼結(jié)構(gòu)特點,將疏水性內(nèi)核作為難溶性藥物的儲庫,親水性
8、外殼則維持膠團在水溶性介質(zhì)的穩(wěn)定性。通過改造現(xiàn)有的化療藥物如以奧沙利鉑為模型,和中藥單體如以姜黃素為模型,制備成不同載藥成分的新型的復(fù)合納米膠束。通過糖脂納米膠束可以被動靶向到腫瘤部位的特性,將藥物在腫瘤組織內(nèi)實現(xiàn)大量聚集,并限制藥物效應(yīng)在腫瘤組織中,在提高對腫瘤組織殺傷力的同時,也減少對正常組織的損傷,克服大腸癌干細胞化療后富集和耐藥,達到同時殺滅大腸癌干細胞和普通腫瘤細胞的目的,是一項有創(chuàng)新意義的研究。
3.研究內(nèi)容:
9、
本研究通過制備殼寡糖硬脂酸納米膠束(CSO-SA)載化療藥物如以奧沙利鉑(oxaliplatin,OXA)為模型,和中藥單體如以姜黃素(curcumin,Cur)為模型,分別評價其抗大腸癌干細胞的藥效學(xué)作用。
3.1 CSO-SA/OXA膠束的制備及抗大腸癌干細胞藥效學(xué)研究:
研究方法:
1)殼寡糖硬脂酸納米膠束(CSO-SA)的合成及其理化性質(zhì)評價:以CSO(18kDa)和SA
10、(C18H36O2)為原料,采用碳二亞胺為交聯(lián)偶合劑,合成CSO-SA膠束。三硝基苯磺酸法測定CSO-SA膠束的氨基取代度;芘熒光法測定CSO-SA的臨界膠束濃度(主要由胡富強實驗室完成)。
2)殼寡糖硬脂酸納米膠束載奧沙利鉑(CSO-SA/OXA)膠束的制備及其理化性質(zhì)評價:采用薄膜分析法制備CSO-SA/OXA膠束;耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測定納米藥物中鉑(Pt)的含量,計算載藥膠束的載藥量和包封率;透射電鏡
11、觀察納米粒子大小及形態(tài)。
3) CSO-SA/OXA膠束殺傷大腸癌干細胞的體外實驗:研究腫瘤細胞及腫瘤細胞球?qū)SO-SA/OXA膠束的攝取能力及作用部位;通過與OXA、CSO-SA膠束比較,利用MTS、無血清條件下細胞成球?qū)嶒?,評價CSO-SA/OXA膠束對大腸癌干細胞毒性效應(yīng)。
4) CSO-SA/OXA殺傷大腸癌干細胞的體內(nèi)實驗:裸鼠皮下成瘤后,OXA、空載體及CSO-SA/OXA膠束溶液尾靜脈分別給藥
12、,評價CSO-SA/OXA膠束抗腫瘤作用的優(yōu)越性:如抑瘤率、大腸癌干細胞比例、腫瘤細胞凋亡情況及對動物本身的毒性。
研究結(jié)果:
1) CSO-SA和CSO-SA/OXA膠束的合成及表征
粒徑分析表明,CSO-SA膠束的平均粒徑為25.4 nm,Zeta電位29.9 mV;而OXA載入CSO-SA膠束后,平均粒徑90 nm,Zeta電位24.4 mV。透射電鏡下觀察該納米膠束具有規(guī)整的球形外觀,在
13、溶液中分散良好。CSO-SA/OXA膠束包封率(EE)的可達60 wt%。釋放曲線顯示:在48 hr內(nèi),超過90%的OXA從CSO-SA/OXA膠束中釋放,藥物且能較平緩釋放。
2) CSO-SA/OXA膠束在體外能有效殺傷大腸細胞與CSCs
MTS檢測顯示:CSO-SA/OXA膠束在體外能有效殺傷大腸癌細胞與大腸癌CSCs;無血清條件下可有效的抑制大腸癌細胞球的形成。
3) CSO-SA/OX
14、A膠束增強體內(nèi)抗腫瘤的療效和減少CSCs富集
CSO-SA/OXA膠束顯著的增強抗腫瘤療效和減少體內(nèi)CSCs富集,而且沒有增加對小鼠本身的毒性;但作為對照的OXA在抑瘤的同時卻導(dǎo)致CSCs的富集。
4)CSO-SA/OXA膠束對腫瘤細胞和CSCs殺傷作用可能與其突出的細胞穿透能力,及提高藥物在腫瘤組織和細胞核內(nèi)的積累有關(guān),具體機制有待進一步研究。
結(jié)論:
制備的CSO-SA/OXA
15、膠束,具有優(yōu)良的細胞攝取內(nèi)化能力;在體外, CSO-SA/OXA膠束可以同時殺滅大腸癌CSCs與非CSCs;在小鼠活體內(nèi),CSO-SA/OXA膠束能夠有效抑制腫瘤的生長和CSCs富集。CSO-SA/OXA膠束增強抑瘤療效,可能與復(fù)合納米藥物作用于細胞核,具有較高的細胞內(nèi)藥物累積及與膠束在腫瘤組織內(nèi)有效緩釋有關(guān)。
3.2新型CSO-SA/Cur膠束的制備及抗大腸癌干細胞藥效學(xué)研究:
研究方法:
1
16、)同3.1方法合成CSO-SA。
2) CSO-SA/Cur膠束的制備及其理化性質(zhì)評價:采用復(fù)合法制備CSO-SA/Cur膠束;熒光分光光度計測定姜黃素(curcumin,Cur)濃度,計算CSO-SA/Cur膠束的載藥量和包封率;透射電鏡觀察CSO-SA/Cur膠束的粒子形態(tài);以及CSO-SA/Cur膠束水溶性和穩(wěn)定性檢測。
3) CSO-SA/Cur膠束對大腸癌干細胞作用的體外實驗:腫瘤細胞對復(fù)合納米藥物
17、的攝取能力評價;通過與空載體及游離姜黃素比較,評價CSO-SA/Cur膠束對大腸癌CSCs殺傷效應(yīng)。
4) CSO-SA/Cur膠束對大腸癌干細胞作用的體內(nèi)實驗:構(gòu)建大腸癌動物模型,觀察CSO-SA/Cur膠束在腫瘤的分布情況及對大腸癌CSCs的殺傷作用。
研究結(jié)果:
1) CSO-SA/Cur膠束的合成及表征:粒度分析表明,所得包裹了藥物納米膠束的平均粒徑114.9 nm,Zeta電位18.5
18、 mV,透射電鏡下觀察該納米膠束具有規(guī)整的球形外觀;而且重點考察了CSO-SA/Cur膠束的溶解性、穩(wěn)定性,證實CSO-SA/Cur膠束室溫條件下能溶解于水溶液,并且保持相對穩(wěn)定。
2)在體外,CSO-SA/Cur膠束抑制大腸癌細胞生長,效果較姜黃素DMSO溶液高4~6倍;CSO-SA/Cur膠束不但可抑制大腸癌細胞球的形成,而且殺傷大腸癌CSCs。
3) CSO-SA/OXA膠束的體內(nèi)實驗表明:荷瘤鼠尾靜脈
19、給藥14天后,與對照組相比,CSO-SA/Cur膠束能有效的抑制大腸癌移植瘤的生長,更可選擇性的殺傷CSCs,且對小鼠體重?zé)o明顯的影響。
結(jié)論:
我們已成功制備了新型CSO-SA/Cur膠束(已申請發(fā)明專利)。合成的CSO-SA/Cur膠束在水溶液中具有良好的溶解能力。而且,研究結(jié)果清楚地表明,在體外,CSO-SA/Cur膠束可以有效提高抗腫瘤效用,殺傷大腸癌CSCs。而CSO-SA/Cur膠束靜脈給藥不僅能
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