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1、研究背景:
大腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在全球范圍內(nèi),其發(fā)病率居男性腫瘤第三位,女性腫瘤第二位。近年來(lái),隨著干細(xì)胞領(lǐng)域的發(fā)展和對(duì)腫瘤的不斷深入研究,人們發(fā)現(xiàn)腫瘤存在各種不同克隆的癌細(xì)胞,這些不同亞群細(xì)胞之間存在不同分工,其分裂增殖能力也大相徑庭。其中有一小群細(xì)胞與正常干細(xì)胞存在許多共性,包括分化、自我更新能力等,多處于休眠狀態(tài)或分裂緩慢,并有強(qiáng)的致瘤性和對(duì)治療的抵抗,其活性受Hedghog、Wnt和BMP等信號(hào)通路調(diào)節(jié),因此
2、將其命名為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)。盡管這部分CSC細(xì)胞數(shù)量極少,但其對(duì)傳統(tǒng)的放化療非但不敏感,反而可以在治療后被富集,因此CSC的存在被認(rèn)為目前許多腫瘤無(wú)法治愈的根本所在。
與生殖干細(xì)胞不同,成體干細(xì)胞包括CSC多處于靜息狀態(tài),后者即靜息腫瘤干細(xì)胞(quiescent cancer stem cell,QCSC),這種近似于休眠的低代謝狀態(tài)造成其對(duì)放化療不敏感,一旦被重新“喚醒”迅速增殖分裂造成
3、腫瘤復(fù)發(fā)。相比于身體其他器官,腸道有其特殊性。目前認(rèn)為腸道中同時(shí)存在快速分裂與休眠狀態(tài)兩種干細(xì)胞,前者維持著腸道上皮細(xì)胞的頻繁更新,而對(duì)后者的認(rèn)識(shí)直到近年才逐漸明朗。研究人員發(fā)現(xiàn)正常情況下兩種細(xì)胞均可分化為各類(lèi)腸道上皮細(xì)胞,但在一定劑量放射殺傷后,只有后者能夠重建腸道上皮,并且部分分化為快速分裂的干細(xì)胞。由此可見(jiàn)在腸道中,靜息干細(xì)胞才是根源。目前對(duì)于大腸癌靜息腫瘤干細(xì)胞(quiescent colon cancer stem cell,
4、QCCSC)的研究鮮有報(bào)道,根據(jù)CSC理論,我們有理由推測(cè)QCCSC是腫瘤發(fā)生、耐藥和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要原因。
如何有效清除QCSC仍是迄今腫瘤研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。有限的研究表明CSC可特異性高表達(dá)一些抗原,使其更容易受到殺傷性免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的攻擊。有報(bào)道δγT細(xì)胞能特異性殺傷卵巢癌及大腸癌CSC; QCSC特異性高表達(dá)NK細(xì)胞相關(guān)配體,從而更容易受到NK細(xì)胞的攻擊;IFN-α/β能特異性殺傷卵巢癌及膠質(zhì)瘤CSC。以上證據(jù)表
5、明,免疫治療可能成為CSC靶向治療的一種新的策略。
從時(shí)間維度上來(lái)看,靜息只是一個(gè)相對(duì)的細(xì)胞周期狀態(tài)。細(xì)胞從活躍分裂期轉(zhuǎn)為分裂停滯往往存在四個(gè)結(jié)局:老化,凋亡,分化和靜息。因此并非所有腫瘤細(xì)胞從分裂期停滯后就等同于QCSC,而只有具有干細(xì)胞特征的一小群細(xì)胞才能可逆性的在靜息期與活躍分裂期之間轉(zhuǎn)換。雖然QCSC可能只是普通腫瘤細(xì)胞的前一個(gè)狀態(tài),但是大量研究表明兩者在代謝,基因表達(dá)等方面有著巨大的差別,而這種差別很大程度上與表觀修
6、飾有關(guān),其中microRNA是一個(gè)重要的表觀調(diào)控機(jī)制。
microRNA為長(zhǎng)度約18-25個(gè)堿基的單鏈非編碼RNA,可在基因轉(zhuǎn)錄后階段促使靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程。miRNA不僅在胚胎發(fā)育階段起著重要作用,疾病情況下尤其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,以及對(duì)CSC的生物學(xué)行為調(diào)控同樣發(fā)揮著明顯的生物學(xué)作用。如miR-155可抑制E-caderin,上調(diào)ZEB1等促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移增殖;let-7家族則可通過(guò)下調(diào)
7、STAT3信號(hào)通路抑制腫瘤;miR-200c可以抑制BMI1調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞的自我更新;miR-20a通過(guò)上調(diào)AKT信號(hào)通路及抑制PTEN促進(jìn)CSC的耐藥及EMT。然而microRNA在QCSC中的調(diào)控機(jī)制目前尚不明了。
CSC在腫瘤組織中處于核心位置,而QCSC則是其中非常重要的組成部分,具有明顯區(qū)別于普通腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性,其與普通腫瘤細(xì)胞之間的差異分子亦可成為腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵分子。研究QCCSC的靶向清除與mi
8、RNA調(diào)控機(jī)制不僅可進(jìn)一步探究大腸癌發(fā)生發(fā)展中表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制,也可為大腸癌治療提供新的靶點(diǎn)和思路。
研究方法:
本課題利用原代大腸癌細(xì)胞及ATCC標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系,首先通過(guò)PKH細(xì)胞膜染色結(jié)合無(wú)血清克隆球培養(yǎng)體系分離出靜息大腸癌細(xì)胞,并通過(guò)一系列功能學(xué)實(shí)驗(yàn)(耐藥性,克隆球形成能力,動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn),干細(xì)胞基因檢測(cè))鑒定其CSC特性;在此基礎(chǔ)上,通過(guò)凋亡檢測(cè)評(píng)價(jià)了QCCSC與其他亞群細(xì)胞對(duì)IFN-γ的敏感性;結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果
9、,比較不同亞群細(xì)胞IFN-γR的表達(dá)差異,同時(shí)通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn),激光共聚焦等方法檢測(cè)了不同亞群細(xì)胞在IFN-γ刺激下凋亡通路的激活狀況。之后進(jìn)一步通過(guò)對(duì)QCCSC與其他亞群的miRNA芯片比較,結(jié)合生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)miR-4666-3p在QCCSC顯著低表達(dá)于其他亞群細(xì)胞,同時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡,熒光素雙報(bào)告基因等方法驗(yàn)證IFN-γR是miR-4666-3p的靶基因。最后,我們構(gòu)建了miR-4666-3p高表達(dá)/抑制細(xì)胞系,通過(guò)
10、克隆球形成,干細(xì)胞基因檢測(cè),動(dòng)物成瘤等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-4666-3p對(duì)QCCSC自我更新及分化的影響。
研究結(jié)果:
1.PKHhi大腸癌細(xì)胞具有低增殖速度及腫瘤干細(xì)胞特征
結(jié)合PKH細(xì)胞膜染色及無(wú)血清克隆球培養(yǎng)技術(shù),我們將PKHhi細(xì)胞(熒光值>103)定義為靜息大腸癌細(xì)胞,其余細(xì)胞根據(jù)熒光強(qiáng)度分為PKHlow(熒光值102-103)與PKHneg(熒光值<102)亞群。通過(guò)PY-Hoeschest333
11、42雙染流式細(xì)胞檢測(cè)(flow cytometry,F(xiàn)CM)分析,PKHhi細(xì)胞大部分處于G0期(78.07±1.98%),而PKHlow與PKHneg細(xì)胞則大部分處于分裂期或分裂前期。再通過(guò)PKH及7-AAD雙染后FACS分選得到PKHhi(0.87±0.30%),PKHlow(39.2±11.58%)及PKHneg(58.2±8.32%)亞群細(xì)胞;克隆球形成實(shí)驗(yàn)證明PKHhi細(xì)胞具有極強(qiáng)克隆球形成實(shí)驗(yàn),同時(shí)其能夠被奧沙利鉑富集,高表
12、達(dá)干細(xì)胞基因及高裸鼠體內(nèi)成瘤能力,我們證實(shí)了PKHhi細(xì)胞是一群同時(shí)具有低分裂增殖速度與干細(xì)胞特征的細(xì)胞亞群。
2.PKHhi細(xì)胞是一群獨(dú)特的腫瘤干細(xì)胞亞群。
對(duì)PKHhi細(xì)胞進(jìn)行了大腸癌CSC相關(guān)標(biāo)記物的檢測(cè),結(jié)果顯示相比于PKHlow與PKHneg細(xì)胞亞群(PKHlow CD133+,16.4±3.3%; CD44+/CD24+,27.8±7.2%;ALDH1+,3.7±1.4%; PKHneg CD133+,1
13、.5±1.4%; CD44+/CD24+,4.7±1.1%;ALDH1+,0%),PKHhi細(xì)胞雖然高表達(dá)大腸癌干細(xì)胞標(biāo)記(CD133+,57.5%±13.3%;CD44+/CD24+,71.6%±11.8%; ALDH1+,16.3%±2.1%),但這些傳統(tǒng)大腸癌CSC表面標(biāo)志物只表達(dá)于部分PKHhi細(xì)胞,反之亦然。說(shuō)明QCCSC不能為傳統(tǒng)大腸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物所替代。此外,Lgr5+細(xì)胞被認(rèn)為是一群快速分裂的具有大腸癌CSC亞群,F(xiàn)
14、CM檢測(cè)顯示PKHhi與Lgr5相互間幾乎不存在共表達(dá),同時(shí)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),PKHhi細(xì)胞在進(jìn)入增殖分裂后Lgr5表達(dá)逐漸增強(qiáng),提示其兩者可能存在譜系關(guān)系。
3.IFN-γ選擇性殺傷靜患大腸癌腫瘤干細(xì)胞
Annexin-Ⅴ及7-AAD雙染結(jié)果顯示,IFN-γ能特異性抑制大腸癌細(xì)胞的克隆球形成,且呈劑量依賴(lài)性,提示IFN-γ對(duì)CCSC可能存在特異性殺傷作用。然后,我們分別檢測(cè)了PKHhi,PKHlo
15、w及PKHneg對(duì)奧沙利鉑及IFN-γ殺傷作用的敏感性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PKHhi細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑明顯存在化療抵抗,但相比PKHlow及PKHneg細(xì)胞,其對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更為敏感;而PKHlow及PKHneg則恰恰相反,更容易被奧沙利鉑殺傷而對(duì)IFN-γ不敏感。據(jù)此,我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)比較IFN-γ與奧沙利鉑不同時(shí)序組合殺傷PKHhi效應(yīng),發(fā)現(xiàn)IFN-γ同時(shí)聯(lián)合奧沙利鉑可以同時(shí)殺傷PKHhi,PKHlow及PKHneg細(xì)胞,裸鼠移植瘤模
16、型也證實(shí)IFN-γ聯(lián)合奧沙利鉑抑瘤效果最為明顯。
4.靜患大腸癌干細(xì)胞特異性高表達(dá)IFN-γ受體。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們?cè)噲D探索PKHhi對(duì)IFN-γ高敏感性的原因。我們通過(guò)FCM分析發(fā)現(xiàn),PKHhi細(xì)胞高表達(dá)IFN-γR1與IFN-γR2,而PKHlow及PKHneg細(xì)胞的表達(dá)量則較低。接下來(lái)我們通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證明了在IFN-γ作用下,PKHhi細(xì)胞中IFN-γ誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)通路高度激活;對(duì)細(xì)
17、胞IFN-γR進(jìn)行抗體阻斷后,IFN-γ對(duì)PKHhi與其他細(xì)胞亞群的殺傷差異明顯減弱。上述結(jié)果說(shuō)明QCCSC特異性高表達(dá)IFN-γR從而導(dǎo)致了其對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)凋亡的高敏感性。
5.靜息大腸癌干細(xì)胞低表達(dá)miR-4666-3p。
大量證據(jù)表明表觀遺傳學(xué)調(diào)控對(duì)CSC的增殖、分化等存在明顯影響。因此在上述結(jié)論基礎(chǔ)上,我們?cè)噲D從microRNA的層面探索QCCSC與其他亞群細(xì)胞間存在IFN-γR表達(dá)差異的原因或上游機(jī)制。我
18、們應(yīng)用miRNA芯片研究發(fā)現(xiàn)QCCSC與普通大腸癌腫瘤細(xì)胞間的miRNA表達(dá)譜具有明顯差異,其中miR-4666-3p在PKHhi細(xì)胞中明顯低表達(dá),提示miR-4666-3p可能為抑癌基因。對(duì)miR-4666-3p靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)其具有潛在抑制大腸癌CSC特征的可能性。同時(shí)我們通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)IFN-γR1/2為miR-4666-3p靶基因。我們證實(shí)IFN-γR1/2mRNA3'端非翻譯區(qū)包含miR-466
19、6-3p的保守結(jié)合位點(diǎn),熒光素雙報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)示miR-4666-3p可引起miRNA靶基因報(bào)告載體熒光強(qiáng)度的明顯改變。且大腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-4666-3p后,IFN-γR1/2表達(dá)均明顯下調(diào)。
6.miR-4666-3p抑制靜息大腸癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新,促進(jìn)其分化。
慢病毒感染成功建立miR-4666-3p大腸癌細(xì)胞高表達(dá)/抑制的穩(wěn)定細(xì)胞系以驗(yàn)證其生物學(xué)功能。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-4666-3p能明顯抑制QC
20、CSC的連續(xù)克隆球形成能力,增強(qiáng)奧沙利鉑敏感性,同時(shí)使得干細(xì)胞相關(guān)基因(KLF4,OCT4,NANOG,SOX2)表達(dá)降低,上皮細(xì)胞分化標(biāo)志E-caderin,Pan-karetin表達(dá)增加;裸鼠體內(nèi)連續(xù)成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-4666-3p具有抑瘤作用。以上結(jié)果均表明miR-4666-3p具有抑癌作用,提示其可成為潛在的治療靶點(diǎn)或抗癌藥物。
研究結(jié)論:
QCCSC是一個(gè)獨(dú)立的腫瘤干細(xì)胞亞群,是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的根源。我們
21、通過(guò)PKH細(xì)胞膜染色結(jié)合無(wú)血清克隆球培養(yǎng)分離出靜息大腸癌細(xì)胞,通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證明其具有相對(duì)靜息及CSC的特性。同時(shí)還率先發(fā)現(xiàn)QCCSC高表達(dá)IFN-γR導(dǎo)致其可以被IFN-γ選擇性殺傷。在其上游機(jī)制研究中,我們首次報(bào)道m(xù)iR-4666-3p低表達(dá)于QCCSC(PKHhi細(xì)胞),且IFN-γR1/2均為其功能靶基因。此外,我們發(fā)現(xiàn)miR-4666-3p具有抑制QCCSC自我更新,促進(jìn)其分化的作用。本研究不僅豐富了大腸癌干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制理論,
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