膜離子通道阻滯及細胞骨架破壞對拉伸應(yīng)力刺激兔關(guān)節(jié)軟骨細胞代謝的影響.pdf

1、目的:探討在拉伸應(yīng)力作用下，膜離子通道阻滯劑和CSK（細胞骨架）破壞劑對離體培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞代謝的影響。
　　 方法:2月齡新西蘭大白兔10只，無菌條件下分離培養(yǎng)雙膝關(guān)節(jié)軟骨細胞，且將其隨機分為8組，對照組、微管破壞組、微絲破壞組、中間纖維破壞組、Na+通道阻滯組、K+通道阻滯組、Ca2+通道阻滯組、Cl-通道阻滯組。在拉伸應(yīng)力（拉伸率為10％，頻率為0.5Hz，正弦波，6h/D）作用下加載3天后，分別加入離子通道阻滯劑（N

2、a+、K+、Ca2+及Cl-通道阻滯劑）和細胞骨架破壞劑（微管破壞劑、微絲破壞劑及中間纖維破壞劑），37℃培育3d。采用HE染色觀察其形態(tài);ELASA法（酶聯(lián)免疫吸附測定法）檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中MMP-13(基質(zhì)金屬蛋白酶-13)、TIMP-1(金屬蛋白酶組織抑制劑-1)的含量;阿爾新藍染色法檢測各組培養(yǎng)液中GAG的含量;RT-PCR的方法檢測各組細胞中Col-Ⅱ(Ⅱ型膠原)、MMP-3（基質(zhì)金屬蛋白酶-3）、TIMP-1、Acti

3、n（肌動蛋白）、Tubulin（微管蛋白）、Vimentin（波形蛋白）mRNA的相對表達量。
　　 結(jié)果:與對照組相比，細胞骨架破壞組及離子通道阻滯組軟骨細胞形態(tài)均出現(xiàn)排列不均勻，形態(tài)各異，細胞核深染，大小不一，細胞質(zhì)減少等現(xiàn)象;且細胞骨架破壞組上清液中GAG濃度均較對照組降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);蛋白水平檢測顯示，微絲、中間纖維破壞組MMP-13濃度較對照組降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，中間纖維破壞組TIMP

4、-1濃度較對照組明顯上升，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);Ca2+、Cl-離子通道阻滯組GAG濃度較對照組降低，有統(tǒng)計學(xué)意義;K+、Cl-通道阻滯組MMP-13濃度較對照組均降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);基因水平檢測結(jié)果與蛋白水平檢測結(jié)果一致;各實驗組軟骨細胞Col-Ⅱ mRNA相對表達量均下調(diào)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:在拉伸應(yīng)力作用下，破壞CSK和阻滯離子通道均使軟骨細胞發(fā)生退化，其中細胞骨架蛋白和Na