miR-10b調(diào)控HOXD10在食管癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的研究.pdf

1、目的:通過檢測miR-10b及其潛在靶基因HOXD10在食管癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)，在細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染及敲除，檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的核酸和蛋白表達(dá)變化以及侵襲遷移能力的改變情況，探討二者的調(diào)控關(guān)系及在食管癌中侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法:通過熒光定量 PCR技術(shù)及蛋白免疫印跡技術(shù)驗(yàn)證30對食管癌組織及癌旁組織和食管癌細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、EC9706、食管永生化上皮SHEE及其癌變細(xì)胞系SH

2、EEC中miR-10b的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，對患者進(jìn)行電話隨訪并分析 miR-10b對患者生存預(yù)后的影響。利用生物信息軟件預(yù)測到下游靶基因?yàn)?HOXD10，驗(yàn)證 HOXD10在食管組織和細(xì)胞上的表達(dá)，并用慢病毒表達(dá)載體對 miR-10b低表達(dá)食管癌細(xì)胞株KYSE30、KYSE140進(jìn)行過表達(dá)轉(zhuǎn)染及對 miR-10b高表達(dá)食管癌細(xì)胞株 EC9706進(jìn)行敲除，用 RT-PCR和 Western Blot方法檢測 HOXD1

3、0的表達(dá)改變的情況，闡明miR-10b對HOXD10調(diào)控關(guān)系，通過Wound healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染及抑制前后細(xì)胞株的侵襲、遷移能力，并檢測促轉(zhuǎn)移因子 MMP-9的表達(dá)情況，探明miR-10b調(diào)控HOXD10基因在食管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.食管癌細(xì)胞和組織中 miR-10b的表達(dá)：食管癌細(xì)胞系中， KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150細(xì)胞系上miR-10b

4、表達(dá)較低，EC9706表達(dá)較高，人食管永生化上皮 SHEE較其癌變細(xì)胞系 SHEEC表達(dá)低；在組織中，食管癌組織較對應(yīng)食管癌旁正常組織 miR-10b表達(dá)較高，在癌中淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移組 miR-10b較未發(fā)生轉(zhuǎn)移高，與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度無關(guān)；miR-10b高表達(dá)組與低表達(dá)組對生存期的影響無明顯差異。
　　2.食管癌細(xì)胞和組織中 HOXD10的表達(dá)：在食管癌細(xì)胞系中， HOXD10 mRNA的表達(dá)在 KYSE30、KYSE

5、70、KYSE140中表達(dá)較高，其余較低， HOXD10蛋白水平表達(dá)最高的是 KYSE140，最低的是 KYSE150；在食管組織中，食管癌組織 HOXD10 mRNA水平較對應(yīng)食管癌旁正常組織較低，蛋白水平同樣癌組織低于癌旁組織。
　　3. miR-10b調(diào)控 HOXD10基因的表達(dá)：生物信息學(xué)軟件預(yù)測提示， HOXD10可能是 miR-10b靶基因之一，在不同細(xì)胞系用慢病毒載體過表達(dá)或抑制 miR-10b，HOXD10蛋白表達(dá)

6、下調(diào)或上調(diào)，對 HOXD10 mRNA水平無明顯影響。
　　4. miR-10b促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲：劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)中， miR-10b在細(xì)胞系過表達(dá)和抑制前后，細(xì)胞的遷移、侵襲能力隨著 miR-10b表達(dá)上調(diào)或下調(diào)而增加或降低。敲除HOXD10之后，也可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，效果類似miR-10b過表達(dá)。
　　5. HOXD10可負(fù)調(diào)控促轉(zhuǎn)移因子 MMP-9影響食管癌侵襲轉(zhuǎn)移：細(xì)胞系中HOXD10基因抑