CIP2A在髓系白血病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 CIP2A在急性髓系白血病中的作用及其機(jī)制
　　 研究目的：
　　 急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一組以髓系造血細(xì)胞的異常增殖、分化障礙、凋亡受阻為特征的惡性克隆性疾病，是成人白血病中最常見的類型。盡管化療方案的改進(jìn)、支持治療的加強(qiáng)、分子靶向藥物的應(yīng)用和造血干細(xì)胞移植技術(shù)的進(jìn)展提高了治療的療效，但60歲以下的患者五年生存率僅為30-40％，60歲以上的患者五年生存率不到

2、10％。因此，研究白血病發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)并研發(fā)相應(yīng)的治療藥物成為血液學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題之一。CIP2A(Cancerous Inhibitorof PP2A，CIP2A)，也稱為KIAA1524、p90，是一種新近發(fā)現(xiàn)的蛋白磷酸酶PP2A(protein phosphatase2A，PP2A)的內(nèi)源性抑制劑。CIP2A通過抑制PP2A對c-Myc蛋白的去磷酸化作用使c-Myc蛋白表達(dá)升高，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞的增

3、殖及錨著非依賴性生長，參與腫瘤的形成。已有研究表明，CIP2A在一些實(shí)體瘤如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胃癌和乳腺癌中過表達(dá)，而它在AML中的表達(dá)狀況及作用尚不明確。本課題通過研究AML患者骨髓標(biāo)本中CIP2A的表達(dá)，以及CIP2A對AML細(xì)胞系HL60增殖、分化與凋亡的影響，探討CIP2A在AML發(fā)病中的作用及其機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1.RT-PCR及Western blot法檢測AML患者中CIP2A的表達(dá)

4、
　　 收集AML患者及健康志愿者的骨髓標(biāo)本，分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取RNA及蛋白，采用RT-PCR及Western blot的方法分別檢測CIP2A在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　 2.用RNA干擾、血清饑餓實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生長曲線、克隆形成實(shí)驗(yàn)、瑞氏染色和流式細(xì)胞術(shù)研究AML中CIP2A的作用及其機(jī)制
　　 以AML細(xì)胞系HL60為研究對象，用CIP2A特異性siRNA沉默CIP2A的表達(dá)，檢測HL60細(xì)胞增殖、

5、分化與凋亡的相關(guān)指標(biāo)，并觀察c-Myc的表達(dá)水平及PP2A活性的變化，探討CIP2A在AML發(fā)病中的作用及機(jī)制。
　　 (1)通過血清饑餓實(shí)驗(yàn)和繪制轉(zhuǎn)染CIP2A siRNA后HL60細(xì)胞生長曲線、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)研究CIP2A對HL60細(xì)胞增殖的影響；
　　 (2)通過瑞氏染色觀察轉(zhuǎn)染CIP2A siRNA后HL60細(xì)胞形態(tài)的變化，并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分化抗原CD11b的表達(dá)探討CIP2A對HL60細(xì)胞分化的影響；

6、
　　 (3)用流式細(xì)胞儀通過Annexin V與PI雙染法檢測HL60細(xì)胞轉(zhuǎn)染CIP2AsiRNA后凋亡率的變化，觀察CIP2A對HL60細(xì)胞凋亡的影響。
　　 (4)檢測沉默CIP2A后c-Myc的表達(dá)及PP2A活性的變化，研究CIP2A作用的機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.CIP2A在AML患者中的表達(dá)
　　 檢測116例AML患者(其中初治組70例，復(fù)發(fā)組14例，完全緩解組32例)和35例

7、健康對照者共151例骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CIP2A的表達(dá)。結(jié)果顯示，在AML初治組中，CIP2A mRNA的陽性率為77.14％(54/70)；在復(fù)發(fā)組中陽性率為70.86％(11/14)，均較完全緩解組及正常對照組有顯著性差異(完全緩解組CIP2A mRNA的陽性率為6.25％，正常對照組為2.86％)(P<0.001)；而初治組與復(fù)發(fā)組、完全緩解組與正常對照組之間CIP2AmRNA陽性率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。應(yīng)用West

8、ern blot的方法檢測了相應(yīng)標(biāo)本的CIP2A在蛋白水平的表達(dá)，初治組和復(fù)發(fā)組標(biāo)本的CIP2A蛋白也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與RT-PCR結(jié)果一致。
　　 2.CIP2A對HL60細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響
　　 (1)CIP2A對HL60細(xì)胞增殖的影響
　　 經(jīng)過72h的血清饑餓，HL60細(xì)胞中CIP2A的表達(dá)水平明顯下降。沉默CIP2A的表達(dá)后，HL60細(xì)胞生長速度減慢，克隆形成能力下降，較對照組有顯著性差異。

9、r>　　 (2)CIP2A對HL60細(xì)胞分化的影響
　　 收集轉(zhuǎn)染CIP2A siRNA后72h的HL60細(xì)胞，瑞氏染液染色后油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，顯示約1/3的細(xì)胞出現(xiàn)了晚期早幼粒細(xì)胞的形態(tài)特征；轉(zhuǎn)染CIP2A SiRNA的HL60細(xì)胞CD11b的表達(dá)率為11.25±2.20％，較轉(zhuǎn)染control SiRNA的HL60細(xì)胞明顯增加，P<0.05。
　　 (3)CIP2A對HL60細(xì)胞凋亡的影響
　　 分別收集

10、轉(zhuǎn)染CIP2A siRNA或control siRNA72h后的HL60細(xì)胞，檢測細(xì)胞凋亡情況，轉(zhuǎn)染CIP2A siRNA組凋亡率為5.1±0.87％；轉(zhuǎn)染control siRNA組凋亡率為0.80±0.30％，二者比較P<0.01。
　　 3.CIP2A對c-Myc表達(dá)和PP2A活性的影響
　　 沉默CIP2A表達(dá)后，c-Myc蛋白的水平隨之下降，PP2A的活性明顯恢復(fù)。
　　 結(jié)論：
　　 1.CI

11、P2A在初治及復(fù)發(fā)的AML患者中高表達(dá)，而在完全緩解的患者及正常對照組的表達(dá)很低，提示CIP2A可能作為AML的腫瘤標(biāo)志。
　　 2.CIP2A在HL60細(xì)胞中的高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞分化和凋亡。
　　 3.CIP2A的生物學(xué)功能與其高表達(dá)引起PP2A活性下降、c-Myc蛋白的表達(dá)升高有關(guān)。
　　 4.抑制CIP2A的表達(dá)是AML細(xì)胞中PP2A活性的恢復(fù)和c-Myc的降解的新途徑，因此干預(yù)CIP2A的表

12、達(dá)有可能作為AML新的靶向治療策略。
　　 第二部分 CIP2A在慢性髓細(xì)胞白血病發(fā)生及急變中的作用及其機(jī)制
　　 研究目的：
　　 慢性髓細(xì)胞白血病(chtonic myelocytic leukemia，CML)是一種獲得性造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，主要涉及髓系。表現(xiàn)為外周血粒細(xì)胞顯著增多并有成熟障礙、脾臟腫大。目前認(rèn)為Ph染色體的出現(xiàn)和BCR/ABL融合基因的形成是CML的主要發(fā)病機(jī)制，而有關(guān)CML急變的

13、機(jī)制仍不明確。CML病程發(fā)展緩慢，分為慢性期(chronic phase，CP)、加速期(accelerated phase，AP)和急變期(blastic phase，BP)三個(gè)時(shí)期。急變期為CML的終末期，CML一旦急變，預(yù)后極差，患者往往在數(shù)月內(nèi)死亡。因此，尋找新的CML急變的相關(guān)基因?qū)τ诮沂綜ML急變的分子機(jī)制及發(fā)現(xiàn)治療的新靶點(diǎn)具有重要的意義。已有研究發(fā)現(xiàn)，CML在發(fā)生及急變的過程中均存在PP2A功能的失活，因此認(rèn)為PP2A抑癌

14、活性的喪失對于CML的發(fā)生甚至急性變都有著至關(guān)重要的作用。CIP2A是新近發(fā)現(xiàn)的一種PP2A的內(nèi)源性抑制劑，主要存在于人類惡性腫瘤組織中，可以直接和c-Myc的氨基末端結(jié)合，保護(hù)c-Myc第62位絲氨酸(serine62，S62)免受脫磷酸作用，阻止c-Myc蛋白的降解，維持其穩(wěn)定，從而抑制c-Myc相關(guān)的PP2A活性。已經(jīng)證實(shí)，CIP2A在一些實(shí)體瘤如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胃癌和乳腺癌中過表達(dá)，而CIP2A在CML中的表達(dá)及其作用

15、尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過研究CIP2A在不同分期CML患者中的表達(dá)和對K562增殖、分化、凋亡的影響以及與BCR/ABL的調(diào)控關(guān)系，探討CIP2A在CML發(fā)生及急變中的作用及其機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1.用RT-PCR、QRT-PCR及Western-Blot法檢測CML患者中CIP2A的表達(dá)
　　 收集不同分期的CML患者及健康志愿者的骨髓標(biāo)本，分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取RNA及蛋白，采用RT-PCR

16、及Western blot的方法分別檢測CIP2A在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。用QRT-PCR法檢測CIP2A mRNA在CML不同分期表達(dá)水平的差異。
　　 2.用RNA干擾、血清饑餓實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生長曲線、克隆形成實(shí)驗(yàn)、瑞氏染色和流式細(xì)胞術(shù)研究CML中CIP2A的作用
　　 以CML急變細(xì)胞系K562為研究對象，采用CIP2A siRNA干擾的方法，沉默CIP2A的表達(dá)，檢測K562細(xì)胞增殖、分化與凋亡的相關(guān)指標(biāo)，從而探

17、討CIP2A在CML發(fā)病中的作用。
　　 (1)通過繪制細(xì)胞生長曲線、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及血清饑餓實(shí)驗(yàn)研究CIP2A對K562細(xì)胞增殖的影響。
　　 (2)通過瑞氏染色觀察轉(zhuǎn)染CIP2A siRNA后K562細(xì)胞形態(tài)的變化，探討CIP2A對K562細(xì)胞分化的影響。
　　 (3)通過Annexin V與PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測K562細(xì)胞凋亡率的變化，觀察CIP2A對K562細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3.用R

18、NA干擾和伊馬替尼干預(yù)研究CIP2A作用的機(jī)制
　　 (1)檢測K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染CIP2A SiRNA后c-Myc表達(dá)水平及PP2A活性的變化。
　　 (2)BCR/ABL對CIP2A的調(diào)節(jié)作用
　　 使用酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate，IM)作用于K562細(xì)胞，檢測CIP2A表達(dá)的變化。
　　 (3)CIP2A對BCR/ABL的調(diào)節(jié)作用
　　 分別轉(zhuǎn)染CIP2

19、A siRNA和CIP2A質(zhì)粒使CIP2A表達(dá)下調(diào)或上調(diào)，檢測BCR/ABL和SHP-1表達(dá)的相應(yīng)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.CIP2A在CML患者中的表達(dá)情況
　　 檢測71例CML患者(CP58例，AP/BP13例)和35例健康對照者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CIP2A的表達(dá)。CML-CP組58例標(biāo)本中44例表達(dá)CIP2A轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，陽性率為75.86％(44/58)；CML-AP/BP組13例標(biāo)本中CIP2A陽性者

20、為10例，陽性率為76.93％(10/13)；正常對照組CIP2A表達(dá)的陽性率僅為2.86％(1/35)。CML-CP組和CML-AP/BP組與正常對照組的CIP2AmRNA的表達(dá)水平均有顯著性差異(P<0.001)。應(yīng)用Western blot的方法檢測了相應(yīng)標(biāo)本的CIP2A在蛋白水平的表達(dá)，CML-CP組和CML-AP/BP組標(biāo)本的CIP2A蛋白也呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，與RT-PCR結(jié)果一致。CML-AP/BP期CIP2A mRNA的表達(dá)

21、水平較CML-CP組明顯增高(P<0.001)，約是CML-CP組的4倍。CIP2A mRNA在CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)與BCR/ABL融合基因的表達(dá)具有一致性。
　　 2.CIP2A對K562細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響
　　 經(jīng)過72h的血清饑餓，CIP2A水平明顯下降。CIP2A siRNA沉默CIP2A的表達(dá)后，K562細(xì)胞生長速度減慢，克隆形成能力下降，72h時(shí)細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，細(xì)胞凋亡增多。

22、>　　 3.CIP2A作用機(jī)制的研究
　　 (1)CIP2A si RNA沉默CIP2A的表達(dá)后，c-Myc蛋白的水平下降，PP2A的活性得到了顯著恢復(fù)。
　　 (2)BCR/ABL對CIP2A的調(diào)節(jié)作用
　　 IM作用于K562細(xì)胞后，BCR/ABL表達(dá)被抑制的同時(shí)，CIP2A的表達(dá)亦明顯下降。
　　 (3)CIP2A對BCR/ABL的調(diào)節(jié)作用
　　 下調(diào)CIP2A的表達(dá)后，BCR/ABL的水

23、平也呈下降趨勢，而SHP-1的表達(dá)則呈現(xiàn)上升趨勢；相反的，上調(diào)CIP2A的表達(dá)可導(dǎo)致BCR/ABL水平升高，SHP-1的表達(dá)下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.CIP2A在CML患者中高表達(dá)，加速期和急變期患者CIP2A-mRNA的表達(dá)水平明顯高于慢性期。提示CIP2A不僅與CML的發(fā)病有關(guān)，而且在CML急變的過程中發(fā)揮了一定的作用。
　　 2.CIP2A在K562細(xì)胞中的高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡。

24、>　　 3.CIP2A的生物學(xué)作用與其高表達(dá)所致的PP2A活性下降、c-Myc蛋白的表達(dá)升高有關(guān)。
　　 4.IM可通過抑制BCR/ABL下調(diào)CIP2A的表達(dá)，豐富了IM的作用途徑。
　　 5.CIP2A與BCR/ABL之間存在著正反饋相互調(diào)節(jié)作用，一方面，CIP2A可抑制c-Myc相關(guān)的PP2A活性，PP2A的失活可以通過SHP-1的介導(dǎo)上調(diào)BCR/ABL的表達(dá)；另一方面，BCR/ABL也可誘導(dǎo)CIP2A表達(dá)，進(jìn)而抑