Gutless腺病毒攜帶多順反子全長全長抗體基因細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)研究.pdf

1、抗體藥物已經(jīng)成為生物制藥行業(yè)最熱門的領(lǐng)域，它能夠特異性的與疾病相關(guān)抗原結(jié)合，通過抗體的封閉作用或招募體內(nèi)的免疫分子實(shí)現(xiàn)靶向性治療的目的。純化的抗體蛋白用于治療仍然難以普及，因?yàn)榭贵w藥物相當(dāng)昂貴，用基因治療的方法攜帶抗體基因在患者體內(nèi)表達(dá)功能性的全長抗體具有光明的前景。使用基因載體表達(dá)抗體，用于研究，可以降低抗體開發(fā)的成本，避免蛋白純化的復(fù)雜過程，縮短研發(fā)周期；用于治療，可以利用生物體自身機(jī)制，在體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生活性治療抗體，獲得持續(xù)的治療效

2、果，避免蛋白的重復(fù)注射的花費(fèi)及副作用?？贵w由輕重鏈形成4亞基復(fù)合體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，決定了抗體基因治療比一般的小分子的基因治療更復(fù)雜，它需要在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)抗體的輕鏈和重鏈。我們使用不同的多順反子結(jié)構(gòu)表達(dá)抗體的重鏈和輕鏈，理論上攜帶抗體多順反子基因的單個(gè)gutless腺病毒顆粒感染細(xì)胞，就能夠在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)抗體的重鏈和輕鏈，然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中裝配而成熟分泌到細(xì)胞外。為了深入的比較研究不同的順反子結(jié)構(gòu)表達(dá)抗體的特點(diǎn)，以及輕重鏈基因順序?qū)ψ罱K

3、表達(dá)量的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)了五種結(jié)構(gòu)，分別為HIL、HAL、LAH、HFL，和LFH，然后將它們分別裝入gutless腺病毒載體中。此外，使用的是肝特異性TTR啟動(dòng)子，將抗體基因表達(dá)限制在肝臟區(qū)域，減少蛋白全身表達(dá)的毒性。 我們成功地?cái)U(kuò)增出五種攜帶抗體多順反子基因的gutless腺病毒。感染多種肝細(xì)胞系，用抗原包被ELISA檢測培養(yǎng)液中抗體表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HIL，HFL在所有細(xì)胞系中都有明顯的抗體表達(dá)，而HAL、LAH只在HepG2和H

4、ep3B細(xì)胞系中有相對(duì)很高的抗體表達(dá)。HAL和LAH表達(dá)細(xì)胞系差異明顯，可能是由于2A序列在這些細(xì)胞中剪切活性的差別造成的。此外，LAH結(jié)構(gòu)表達(dá)量比HAL高，可能是由于2A體外不平衡剪切引起LAH結(jié)構(gòu)輕鏈冗余，促進(jìn)了抗體的裝配與分泌。使用兩種抗體定量的方法，我們測得LAH結(jié)構(gòu)以5000vp/cell感染HepG2細(xì)胞后的細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的表達(dá)量，約300ng/mL。然后，Westernblot分析，檢測到非還原性條件下抗體150KD條帶

5、，也檢測到還原性條件下的輕鏈結(jié)構(gòu)。我們還在購買抗體，改進(jìn)抗體定量和Westernblot檢測方法，期望獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。 我們的試驗(yàn)證明了gutless腺病毒載體用于抗體基因治療具有低細(xì)胞毒性和允許高感染復(fù)數(shù)的特點(diǎn)，這些都有利于高效的抗體表達(dá);提高病毒感染復(fù)數(shù)，即提高外源基因在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)，能夠提高抗體的表達(dá)量。精細(xì)的結(jié)構(gòu)比較中，不同的多順反子結(jié)構(gòu)在不同細(xì)胞系中表達(dá)差異明顯，在BEL7404細(xì)胞系中，HFL和HIL抗體表達(dá)量