碳酸鈣納米介導shRNA抑制VEGF-C基因表達與大腸癌淋巴管生成、淋巴結轉移的研究.pdf

1、結腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，2000年世界癌癥流行趨勢分析表明，全球結、直腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第三位，死亡率居第四位。近些年來我國大腸癌發(fā)病率的上升趨勢亦十分明顯。其中城市結腸癌的發(fā)病率以4％的年增長率遞增，而男性結腸癌患者增加了58.8％。由于其臨床表現(xiàn)常較隱匿且缺乏特異性，難以早期發(fā)現(xiàn)，許多患者就診時已屬于中晚期且大多數有淋巴結轉移。雖然，在200多年前有研究工作者認識到腫瘤淋巴結轉移是腫瘤的預后因素之一，但其確切的機制不是很清

2、楚，因此，闡明腫瘤淋巴結轉移機制有助于腫瘤患者的預后以及選擇正確的治療方法。淋巴管形成促進了腫瘤淋巴結的轉移，VEGF-C是目前己知的促淋巴管生長因子，屬于血管內皮生長因子(VEGF)家族成員之一，據文獻報道在甲狀腺癌、前列腺癌、胃癌、結直腸癌、肺癌、乳腺癌中VEGF-c表達與腫瘤新生淋巴管形成及淋巴結轉移有關。腫瘤細胞產生的VEGF-C與其淋巴管內皮細胞上的受體VEGFR-3結合刺激淋巴管的生成和促進淋巴結的轉移，VEGF-C表達增高

3、通過增加腫瘤細胞與淋巴管內皮細胞的接觸面積、增加管腔的通透性、改變淋巴管內皮細胞黏附性或黏附分子的表達使腫瘤浸潤轉移的能力增強。實驗研究表明VEGF-C/VEGFR-3信號傳導在誘導淋巴管過程中起著重要作用，阻斷該信號通路是抗淋巴管生成治療目前最常用的策略；用于阻斷VEGF-C或VEGF-D與VEGFR-3相互作用的主要方法包括單克隆抗體、可溶性VEGFR-3-Ig、小分子肽抑制劑、前蛋白轉化酶(PCs)抑制劑、基因治療等。 R

4、AN干擾(RNAi)技術是近年來發(fā)展起來的一項特異性抑制基因表達的新方法，它利用了由于小干擾RNA引起的生物細胞內同源基因的特異性沉默現(xiàn)象，其本質是siRNA與對應的mRNA特異結合、降解，從而阻斷mRNA的翻譯，它普遍存在各種生物，是一種集快捷、高效、特異性強于一體的抑制基因表達的技術手段，可廣泛用于基因功能測定及基因治療等方面。 基因治療的載體問題以及載體相關的免疫反應、細胞毒性與安全性問題成為基因治療和臨床應用的瓶頸。目前

5、，基因治療常用的載體系統(tǒng)主要包括兩大類：病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體系統(tǒng)有慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體等，是目前基因治療研究中最常用的一類載體。腺病毒不能穩(wěn)定整合于宿主細胞基因組內，故難以長期穩(wěn)定表達，甚至可能引起機體強烈的免疫反應：腺相關病毒載體容量小，難以為大片斷基因所利用，且制備困難；使得從逆轉錄病毒到腺病毒載體的安全性受到質疑，研究者的目光亦從病毒載體轉移到非病毒載體上。傳統(tǒng)的非病毒載體如脂質體、肽類化合

6、物、陽離子聚合物等，雖然安全，但基因傳遞效率極低，難以獲得有意義的基因表達。因此，進一步開發(fā)安全、有效并具有優(yōu)良特性的非病毒基因轉運載體系統(tǒng)是發(fā)展基因治療的當務之急。近年來發(fā)展起來的一種新型非病毒基因轉運載體-納米粒基因轉運載體有望突破這一瓶頸，使基因治療發(fā)展成為臨床常規(guī)治療手段。納米顆粒因為具有小尺寸效應，表面效應，隨著顆粒直徑變小，比表面積將會顯著增大，故具有很高的化學活性，因而納米成為了最有應用前景的非病毒載體。研究表明，納米顆粒

7、在體內的循環(huán)時間明顯長于普通大小的顆粒，在短時間內，不會很快被吞噬細胞清除，從而更多的滲出到血管外、組織間隙，延長與細胞的接觸時間，提高轉染效率；通常質粒DNA進入血管后很快被核酸酶消化降解，但納米基因載體有濃縮，保護DNA功能，與DNA形成一致密的結構，使DNA不被核酸酶消化降解。 目的：用化學方法構建一種新型非病毒轉基因載體-碳酸鈣納米，并以此載體轉染表達載體質粒pGenesil-siRNA-VEGF-C，通過體外實驗和裸鼠

8、體內實驗了解質粒pGenesil-siRNA-VEGF-C能否特異性干擾大腸癌細胞株LOVO細胞中VEGF-C基因的表達以及能否影響裸鼠移植瘤中淋巴管的生成以及局部淋巴結的轉移。 方法： 1.利用氯化鈣與碳酸鈉反應生成碳酸鈣的原理制備新型非病毒轉基因載體-碳酸鈣納米；利用zetasize DELSA-400檢測碳酸鈣納米粒徑表面電荷和透射電子顯微鏡檢測碳酸鈣納米粒徑大小，通過瓊脂糖凝膠實驗檢測碳酸鈣納米對DNA的結合和保

9、護的最佳比例，并用流式細胞儀、MTT實驗檢測其轉染效率及其對細胞的毒性。 2.采用Western blot、RT-PCR技術，在蛋白質和mRNA水平檢測VEGF-C基因在不同消化道腫瘤細胞株中的表達。 3.利用計算機在線軟件設計針對VEGF-C基因特定序列的寡核苷酸片斷，并將其定向克隆入真核表達載體，成功構建重組質粒pGenesil-siRNA-VEGF-C1、pGenesil-siRNA-VEGF-C2、pGenesi

10、l-siRNA-VEGF-C3和陰性對照質粒pGenesil-siRNA-HK。 4.用碳酸鈣納米將構建的真核表達質粒轉染入大腸癌細胞株LOVO細胞，應用實時熒光定量PCR、Westren blot技術檢測VEGF-CmRNA和蛋白表達變化的情況，用MTT檢測其對細胞增殖抑制情況。 5.建立裸鼠移植瘤模型，進行瘤內注射質粒，每3天一次，共8次，4周后處死裸鼠測腫瘤重量，并繪制腫瘤生長曲線，免疫組化和Western blo

11、t技術檢測腫瘤組織VEGF-C蛋白表達變化情況，免疫組化染色計數移植瘤組織中微淋巴管和微血管的密度，并計算移植瘤細胞的凋亡指數。 結果： 1.成功制備了一種新型的非病毒轉基因載體-碳酸鈣納米，其表面電荷為28.6mv，粒徑為58nm，與DNA結合的最佳比例為15:1，轉染效率為53.38％。 2.三株細胞均有VEGF-C表達，LOVO、SW-620、SGC-7901中VEGF-C蛋白的表達量分別是0.52±0.0

12、3，0.34±0.02， 0.31±0.03，LOVO細胞株中VEGF-C的蛋白量與SW-620、SGC-790l細胞株中VEGF-C蛋白量比較差別有顯著性SGC-7901、LOVO、SW-620中VEGF-C mRNA的表達量分別是0.27±0.03、0.64±0.04、0.30±0.02，LOVO細胞株中VEGF-CmRNA的表達量最高。與其它兩株細胞相比差別有顯著性。 2.經酶切和測序分析證實成功構建了真對VEGF-C基因

13、小分子RNA干擾表達載體質粒。 3.重組質粒pGeneesil-shRNA-VEGF-C1、pGeneesil-l-shRNA-VEGF-C2、pGeneesil-l-shRNA-VEGF-C3用碳酸鈣納米轉染入LOVO細胞三天后，蛋白表達抑制率分別為4.330％，35.437％，34.710％；mRNA的抑制率分別為3.079％，45.545％，43.178％。 4.重組質粒pGeneesil-l-shRNA-VEGF