人工腎小球濾過膜的初步研究.pdf

1、第一部分：多聚硅裂孔薄膜微結(jié)構(gòu)支架制備
　　背景：腎臟的主要功能是排泄代謝廢物，調(diào)節(jié)水電解質(zhì)和酸堿平衡，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。為此，它首先需要將血液進行選擇性濾過，然后再通過腎小管的重吸收和分泌功能來完成這一功能。目前體外模擬腎臟功能的常用方法是血液透析，其核心部件則是透析膜。臨床廣泛應用的血液透析膜是一種高分子材料，通過紡絲工藝加工而成，這類膜均存孔徑不均一，大小不等，厚度常有數(shù)十微米，且很難進一步壓縮其體積，也很難進一步添加其他

2、處理元件，如感受器、微型開關(guān)等。為此，我們希望能選用一種全新的材料和工藝，以制造一種全新的濾過膜，以便更好的模擬腎小球濾過膜，并希望未來能在此膜上增加其他處理元件，如容量感受器，微型馬達、開關(guān)等元件。
　　方法：我們選用MEMS工藝，利用硅為主要支架，金屬作為多孔隙薄膜這樣一個整體框架，該支架結(jié)構(gòu)以硅作為支架基底，在硅支架底面開矩形陣列窗口，在硅支架表面制備金屬濾過膜。濾過膜結(jié)構(gòu)中包含濾過膜孔，其結(jié)構(gòu)可以自由選擇，而不僅限于圓孔狀

3、結(jié)構(gòu)。具體步驟為：1、選擇雙面拋光并氧化處理的硅片作為基片，通過高能離子束物理轟擊，以去除基體表面吸附的顆粒及有機污染物；2、采用Karl Suss公司RC8型甩膠臺進行甩膠，控制膠厚度為5微米；3、采用一定的烘溫程序?qū)饪棠z進行烘烤；4、采用Karl Suss MA6/BA6雙面光刻機對光刻膠進行曝光。采用“F”型對準標記，實現(xiàn)掩膜與基片之間的對準，以此確保各層圖形的精確對準。曝光光線為波長4000A的紫外光，曝光功率為275瓦，曝光

4、方式為掩膜版與光刻膠表面直接接觸的接觸式曝光，這樣可以得到較高的分辨率，減少圖形失真；5、采用固定浸沒式顯影，以便對經(jīng)過曝光，溶解性發(fā)生變化的、已“潛影”的光刻膠進行選擇性溶解。光刻膠經(jīng)過顯影后用去離子水清洗基片并將基片旋轉(zhuǎn)甩干，去除顯影后殘留在基片表面的所有化學藥品。然后通過普通光學顯微鏡檢查顯影的效果。如果顯影參數(shù)控制不當，顯影圖形可出現(xiàn)缺陷以至影響后續(xù)工藝。如有明顯顯影缺陷，則將基片去膠后重新進行甩膠與光刻工藝；6、光刻膠經(jīng)過顯影

5、、清洗后，在烘箱中進行烘培堅膜處理，隨后在空氣中自然冷卻。7、采用濕法刻蝕工藝以選擇性刻蝕二氧化硅，刻蝕液為氫氟酸刻蝕液。8、在另一面分別濺射鉻和銅，其中鉻是用于鍵合多金屬層的粘結(jié)層，而銅為電鍍種子層。9、再次通過旋涂光刻膠、曝光、顯影等步驟進行圖像轉(zhuǎn)移，然后電鍍鎳以形成濾過膜，10、去除殘余的光刻膠；11、分別刻蝕硅和二氧化硅；在對硅進行刻蝕時，選用氫氧化鉀堿性溶液作為硅的濕法刻蝕溶液。12、最后電鍍金。
　　結(jié)果：我們基于標準

6、MEMS工藝對以硅為基礎的材料進行圖形化、刻蝕、濺射、電鍍等一系列加工，在加工期間，對各項加工參數(shù)進行了仔細的優(yōu)化，摸索出一套適合本研究的條件。最終，在我們所設計的硅支架上面形成了一層多孔隙薄膜，該膜厚度約為2-3微米，為了后續(xù)研究方便，我們將它切割成1cm×1cm或2cm×2cm大小的方形硅片。最后將所有樣品均置于顯微鏡下，仔細觀察孔徑形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：硅支架強度高，表面膜結(jié)構(gòu)完整，其孔隙形態(tài)規(guī)整，大小一致，完全符合設計要求。

7、>　　結(jié)論：MEMS工藝制備的濾過膜孔隙完全規(guī)整，其大小、形狀分布等均可以根據(jù)要求進行自由設計和改變，薄膜的厚度約為2-3微米，同時具有較高的強度。
　　第二部分：多聚硅裂孔薄膜的生物相容性和細胞毒性研究
　　前言：所有和體液接觸或計劃植入體內(nèi)的材料，必須保證生物相容性良好。而且，為了更好的模擬腎小球功能，我們計劃在此多聚硅裂孔薄膜上培養(yǎng)足細胞或內(nèi)皮細胞。為此，我們首先需要了解該人工濾過膜對細胞的生物相容性，并了解細胞能否在

8、該人工濾過膜上粘附、增生、分化并發(fā)揮其功能。
　　材料與方法：前期合成的多聚硅裂孔薄膜經(jīng)檢驗合格，用稀鹽酸浸泡，以清除前期加工過程中可能殘留的各種雜質(zhì)，然后采用常規(guī)消毒滅菌。晾干后分別給予Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原和Laminin包被，然后通過掃描電鏡觀察包被液對孔徑大小的影響。我們在該薄膜上進行細胞培養(yǎng)，觀察包被前后細胞增生情況。并觀察培養(yǎng)時死活細胞比例，同時通過MTT試驗了解該薄膜對細胞是否存在一定毒性作用。隨后我們觀察了在該薄膜上培

9、養(yǎng)系膜細胞/MDCK細胞時細胞外基質(zhì)(纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原)和炎性因子(IL-1BETA和TNFalpha)的分泌情況。最后，通過掃描電鏡觀察了MDCK細胞的形態(tài)。
　　結(jié)果：1、我們在電鏡下分別觀察了多聚硅裂孔薄膜在細胞外基質(zhì)包被前后孔徑大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同細胞外基質(zhì)包被前后膜孔徑并沒有改變；2、我們的研究表明，當孔徑為15μm或以上時，細胞很難在膜上粘附、生長，增殖，當我們縮小膜孔徑后發(fā)現(xiàn)，在不對多聚硅裂孔薄膜預先進行細胞外

10、基質(zhì)包被的情況下，細胞仍表現(xiàn)為粘附稀疏，培養(yǎng)困難。而預先予細胞外基質(zhì)包被后，則細胞容易粘附，增生，并較容易形成單層融合。3、不同包被基質(zhì)對細胞的粘附和生長作用并不完全相同，其中l(wèi)v型膠原包被組在細胞培養(yǎng)初始階段(1-2天時)就有明顯的增生，且與其他組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。但隨著培養(yǎng)時間的延長，各組間差異消失。細胞數(shù)量在第4天時達到一個頂峰，而進一步延長培養(yǎng)時間，則細胞數(shù)量有下降趨勢(見圖2-3)。4、在多聚硅裂孔薄膜上培養(yǎng)細胞時

11、，在增殖階段，死細胞數(shù)約占總細胞數(shù)量的5-13％，這與普通玻璃上培養(yǎng)時非常類似。提示該薄膜對細胞沒有明顯的毒性作用，并不促進細胞死亡；MTT試驗進一步證實了這一點。5、在多孔隙薄膜上培養(yǎng)系膜細胞時，炎癥因子IL-1beta和TNF-ALPHA的釋放并不明顯，與普通培養(yǎng)條件類似(IL-1BETA：136.5±20.2Vs134.2±28.5ng/ml；P>0.05；TNFALPHA；107.3±21.6VS119.0±18.2，P>0.0

12、5)；而在給與脂多糖刺激后，人系膜細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-ALPHA明顯增多《689.0±31.7，658±45.3，和對照組相比，P<0.05)。6、我們在細胞培養(yǎng)上清液中，檢測到游離的Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白。多聚硅裂孔薄膜對細胞外基質(zhì)的合成沒有明顯的刺激或削弱作用。7、掃描電鏡觀察結(jié)果表明，培養(yǎng)約3-4天后，MDCK細胞就基本形成了扁平融合的單層細胞，細胞形態(tài)與常規(guī)培養(yǎng)類似。進一步培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，細胞數(shù)量并不再增加，但細胞由既往

13、的扁平狀變成了立方狀，細胞與細胞之間結(jié)合緊密，頂端有大量微絨毛形成，提示其功能活躍。
　　結(jié)論：我們的研究表明，基于MEMS工藝所制成的多孔隙薄膜對細胞沒有明顯的毒副作用，不刺激細胞釋放炎性因子，不促進細胞的死亡。對該薄膜預先進行細胞外基質(zhì)包被，將明顯促進細胞的粘附，生長，增殖。經(jīng)過表面修飾后，MDCK細胞和系膜細胞能在該多孔隙薄膜上粘附、生長，增殖、分化，且形態(tài)完好，提示其功能正常。
　　第三部分：濾過性能測定
　　

14、前言：目前研究表明，腎小球濾過屏障主要由內(nèi)皮細胞、基底膜和足細胞構(gòu)成，足細胞在其中發(fā)揮著非常重要的作用。因此，我們在多聚硅裂孔薄膜上培養(yǎng)足細胞，并檢測了這一復合膜的濾過性能。
　　方法：在多聚硅裂孔薄膜上培養(yǎng)永生化的足細胞，待細胞鋪滿整個薄膜后，將其放入自制測定小室中，薄膜一側(cè)為含不同分子量的溶質(zhì)的細胞培養(yǎng)液流過，然后檢測流入、流出液中各種溶質(zhì)的濃度，并檢測濾過液的量，以計算其濾過分數(shù)和溶質(zhì)的表觀清除率。
　　結(jié)果：1、在本

15、研究中，我們通過調(diào)節(jié)氣泵將跨膜壓設定為10mmHg，通過蠕動泵將細胞培養(yǎng)液的流入速度恒定為2ml/min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定時間內(nèi)，濾過液的流速基本恒定為0.52±0.07ml/min。提示該膜的濾過分數(shù)約為26％。我們測得維生素B12的表觀清除率為1。白蛋白表觀清除率約為0.136，人免疫球蛋白lgG表觀清除率約為0.019。2、通過調(diào)節(jié)氣泵改變?yōu)V過膜的跨膜壓力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當跨膜壓大于40mmHg時，一般均能在濾過液中檢查到紅細胞，提示

16、在此壓力下較容易出現(xiàn)破膜現(xiàn)象，而在20mmhg以下時，多次檢測濾過液，均未發(fā)現(xiàn)有明顯紅細胞存在。提示在此壓力下，不易出現(xiàn)破膜。3、在液體流量為2ml/min，跨膜壓為10mmHg的情況下，循環(huán)2小時后，取細胞培養(yǎng)液及濾過液，結(jié)果未能在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)脫落的足細胞，但如果將時間繼續(xù)延長，則有時可在細胞培養(yǎng)液中找到脫落的足細胞。
　　結(jié)論：多聚硅裂孔薄膜培養(yǎng)足細胞后對細胞培養(yǎng)液的濾過分數(shù)為26％。該生物人工復合膜對小分子物質(zhì)能完全濾過，但