紅麻CMS的轉(zhuǎn)錄組比較分析及SF3基因的功能研究.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)廣泛存在于植物界，是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑。對(duì)CMS發(fā)生的分子機(jī)制的研究能為人工不育系的構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)，因此，探索、發(fā)掘與CMS相關(guān)的基因功能具有重要意義。本研究通過對(duì)紅麻不育系和保持系花藥RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建紅麻花藥發(fā)育的基因表達(dá)譜，研究紅麻花藥發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)DGE(Differential GeneExpr

2、ession)分析結(jié)果并結(jié)合RT-PCR篩選，最終選定花粉特異蛋白SF3(Pollen specificprotein SF3)基因作為研究對(duì)象，對(duì)其克隆，表達(dá)模式分析并構(gòu)建載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能研究，主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析最終得到54563個(gè)基因Unigenes，其中有45930(84％)的序列與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)應(yīng)，15977(29％)的序列與286個(gè)KEGG途徑有關(guān)，20289(37％)個(gè)屬于直系同源基因家族

3、大類，38611(71％)個(gè)基因都至少有一個(gè)GO，它們分為50個(gè)功能基因組，通過數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)的方法，在對(duì)比不育系與保持系中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有4584個(gè)基因至少有2倍以上的差異;充分分析這些差異表達(dá)基因的GO條目和KEGG途徑發(fā)現(xiàn)，這些差異基因可分為155個(gè)GO條目，主要存在于74個(gè)KEGG途徑中，其中有67個(gè)轉(zhuǎn)錄本只存在于不育系基因組，78個(gè)轉(zhuǎn)錄本只存在于保持系。
　　2.采用同源克隆的方法，將SF3基因測(cè)序拼接的序列結(jié)果與高

4、通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列相比對(duì)，選取同源性較高的基因序列。用ORF finder尋找其最長(zhǎng)的開放閱讀框，在開放閱讀框序列收尾的起始密碼子和終止密碼子前后設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該基因全長(zhǎng)，通過比對(duì)找到SF3基因的全長(zhǎng)。
　　3.在差異基因中選用紅麻花粉特異蛋白SF3基因作為主要研究對(duì)象，通過RT-PCR技術(shù)，基因克隆獲得SF3基因在紅麻P3A、P3B不同時(shí)期花藥和根的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在同一品種間單核期與雙核期SF3基因的表達(dá)量有明顯的差異，這與已知的

5、研究結(jié)果SF3基因在花粉的發(fā)育中是累積的一致;同一時(shí)期不育系和保持系中，不育系SF3的表達(dá)量低于保持系，但是在根中兩系中并無明顯差別，這或許能說明該基因在P3A和P3B中表達(dá)量具有時(shí)空特異性。
　　4.根據(jù)SF3基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)載體，選用其特異序列為干擾區(qū)，構(gòu)建SF3 RNAi干擾載體和正義表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究該基因在紅麻發(fā)育中的功能奠定理論基礎(chǔ)。由于該基因與煙草相比其同源性大于(75％)，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)煙草方法將RNA