通絡(luò)方藥調(diào)脂、抑炎及抗凝作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、論文Ⅰ通心絡(luò)調(diào)脂、抑炎及抗凝作用的機(jī)制研究 背景： 本研究以辛伐他汀作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型方法，運(yùn)用分子生物學(xué)及組織學(xué)等技術(shù)，觀察通心絡(luò)超微粉通過(guò)調(diào)脂、抑制炎癥反應(yīng)和抗凝作用防治動(dòng)脈粥樣硬化的療效，并闡明其分子生物學(xué)機(jī)制及相互作用的聯(lián)系靶點(diǎn)。 目的： （1）建立與人類動(dòng)脈粥樣硬化病變特征相似，易于觀察藥物療效的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型； （2）應(yīng)用血清學(xué)、組織學(xué)

2、及分子生物學(xué)技術(shù)觀察動(dòng)脈粥樣硬化病變過(guò)程中脂質(zhì)、炎癥及凝血機(jī)制的變化，并找出共同作用的靶點(diǎn)； （3）對(duì)比不同劑量通心絡(luò)超微粉和辛伐他汀治療防治動(dòng)脈粥樣硬化的療效及其分子生物學(xué)機(jī)制。 方法： 1.動(dòng)物模型的建立 健康雄性新西蘭大白兔，在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用球囊損傷腹主動(dòng)脈后，應(yīng)用含有1％高膽固醇飼料喂養(yǎng)10周。 2.實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 造模成功后隨機(jī)分為對(duì)照組、小劑量、中劑量、大劑量通心絡(luò)

3、組和辛伐他汀組： 3.稱量體重 實(shí)驗(yàn)前、10周造模后及18周末藥物干預(yù)后分別對(duì)所有實(shí)驗(yàn)兔稱量體重。 4.高頻體表超聲檢查 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、10周末、18周末行腹主動(dòng)脈高頻體表超聲檢查。測(cè)量腹主動(dòng)脈后壁內(nèi)膜-中層厚度、腹主動(dòng)脈收縮期血流峰值速度。 5.肝腎部分功能檢查 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、10周末及18周末，采血作血液生化檢查，主要包括ALT， GGT，TBIL，BUN和Cr。 6.血脂

4、檢測(cè) 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、10周末及18周末采血作血液生化檢查。采用酶法測(cè)定血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇及高密度脂蛋白膽固醇水平。 7.血清炎性因子的檢測(cè) 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、10周末及18周末采血，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)氧化低密度脂蛋白、血清高敏C反應(yīng)蛋白、血清sICAM-1及sVCAM-1的濃度。 8.血漿纖溶指標(biāo)的檢測(cè) 分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、10周末及18周末采血，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)血

5、漿PAI-1、t-PA的濃度水平。 9.病理染色 留取球囊拉傷處腹主動(dòng)脈標(biāo)本，行蘇木素-伊紅染色、油紅O染色和Movat五色套染法染色。 10.免疫組織化學(xué)染色 對(duì)腹主動(dòng)脈球囊損傷處血管段進(jìn)行組織切片，行膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白、RAM11、VCAM-1、ICAM-1、及CRP免疫組織化學(xué)染色，此外并對(duì)肝臟組織切片行CETP及LRP的免疫組織化學(xué)染色。 11.Western bl

6、ot 留取肝臟及血管標(biāo)本，檢測(cè)組織中CETP及LRP蛋白表達(dá)水平。 12.掃描電鏡 各組均留取標(biāo)本進(jìn)行掃描電子顯微鏡檢查，觀察血管內(nèi)膜損傷及脂質(zhì)沉積的情況。 13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，連續(xù)性數(shù)據(jù)用x±SD表示，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況 進(jìn)入藥物干預(yù)階段的實(shí)驗(yàn)兔中，辛伐他汀組死亡1只，大劑量通心絡(luò)組死亡2只，中、小劑

7、量通心絡(luò)組各死亡1只，死亡原因分別為腹瀉、呼吸道感染或原因不明。 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重的變化 10周術(shù)所有實(shí)驗(yàn)兔體重均較實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前加重，相比均有顯著性差異，但治療后各組實(shí)驗(yàn)兔之間無(wú)顯著差異。 3.高頻體表超聲 10周末，所有實(shí)驗(yàn)兔IMT均顯著升高，Vp值顯著升高；治療后C、D、E三組IMT較對(duì)照組相比顯著降低，D、E兩組Vp值顯著降低。 4.肝腎功能檢測(cè) 18周末，辛伐他汀組血清ALT、GGT

8、兩者濃度顯著高于其他組，其他各組之間無(wú)顯著差異。 5.血脂檢測(cè) 組內(nèi)比較：10周末，除HDL-C外，所有實(shí)驗(yàn)兔較造模前各項(xiàng)指標(biāo)相比均顯著升高；18周末，各組血脂含量除HDL-C外，與治療前相比均顯著降低。 治療后組間比較：與A組比較，各藥物治療組均可明顯降低血清TC水平，大劑量通心絡(luò)組和辛伐他汀組組間無(wú)顯著性差異；大劑量通心絡(luò)組TC水平明顯低于小劑量通心絡(luò)組； 6.血清炎性因子的檢測(cè) 組內(nèi)比較：1

9、0周末造模成功實(shí)驗(yàn)兔血清ox-LDL、hs-CRP、sICAM-1及sVCAM-1水平較實(shí)驗(yàn)初始相比均顯著升高；18周末，C、D、E各組炎性因子血清水平均顯著下降。 組間比較：與A組比較，治療后中、大劑量通心絡(luò)組和辛伐他汀組均可明顯降低血清炎性因子hs-CRP的水平，由低到高依次為E組、D組和C組。D組與E組降低hs-CRP水平無(wú)顯著性差異； 7.血漿纖溶指標(biāo)的檢測(cè) 組內(nèi)比較：治療后除對(duì)照組外，其他各組血漿PAI

10、-1水平顯著降低，t-PA水平均顯著升高。 組間比較：18周末，與對(duì)照組相比，B、C、D三組血漿PAI-1水平顯著降低，C、D兩組最顯著；與對(duì)照組比較，C、D、E三組血漿t-PA水平顯著升高，但以D組差異最顯著。 8.病理染色 HE染色顯示，造模成功后各組血管斑塊明顯，治療后各組間未見(jiàn)明顯差異；油紅“O”染色顯示，對(duì)照組斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量顯著高于藥物組；Movat結(jié)果顯示，對(duì)照組動(dòng)物斑塊內(nèi)部基質(zhì)和粘蛋白含量顯著高于

11、藥物組，各藥物組間未見(jiàn)差異。 9.免疫組織化學(xué)染色 五組斑塊內(nèi)均有CETP、LRP、RAM11、VCAM-1、ICAM-1、及CRP的局部表達(dá)；與對(duì)照組相比，藥物組LRP、RAM11、VCAM-1、ICAM-1及CRP表達(dá)均顯著減少，其中D、E兩組較其他3組相比表達(dá)更低，而C組和B組間未見(jiàn)差異；E組CETP蛋白表達(dá)顯著低于其他四組，四組間比較無(wú)顯著差異。肝臟CETP及LRP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與其血管斑塊內(nèi)表達(dá)結(jié)果相似。

12、 10.Western blot 各組肝臟及斑塊中均有CETP、LRP的高度表達(dá)，其中D、E兩組LRP蛋白表達(dá)顯著低于其他三組，兩組間無(wú)顯著差異；E組CETP蛋白表達(dá)水平顯著低于其他四組，其余四組間比較無(wú)顯著差異。 11.掃描電鏡 各組內(nèi)皮細(xì)胞均有不同程度損傷，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜較多區(qū)域有細(xì)胞脫落，暴露內(nèi)皮下膠原，脫落區(qū)附近有大量紅細(xì)胞、血小板及脂滴黏附，低倍鏡下可見(jiàn)病變區(qū)域廣泛，內(nèi)皮隆起區(qū)

13、域部分融合，形成表面粗糙的“斑塊”狀病變。A組內(nèi)膜損傷顯著甚于其他藥物組，藥物組間比較發(fā)現(xiàn)，D、E兩組損傷顯著較輕，C組和B組間未見(jiàn)顯著差異。 結(jié)論： （1）應(yīng)用球囊損傷加高脂飼養(yǎng)方法可建立與人類動(dòng)脈粥樣硬化病變特征相似、造模時(shí)間短及適于觀察藥物療效的動(dòng)物模型，結(jié)合血脂水平的檢測(cè)，應(yīng)用高頻體表超聲可判定模型的建立情況。 （2）通心絡(luò)超微粉能夠不通過(guò)抑制CETP升高HDL-C，保護(hù)了體內(nèi)的正常膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

14、 （3）大劑量通心絡(luò)超微粉能有效降低血脂，抑制炎癥反應(yīng)及增強(qiáng)纖溶功能其作用的共同靶點(diǎn)可能是LRP。 論文Ⅱ薤白對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞組織因子及其抑制物表達(dá)的干預(yù)作用 背景： 本實(shí)驗(yàn)采用原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，以ox-LDL作為內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的誘導(dǎo)因子，觀察了不同濃度及不同時(shí)間點(diǎn)ox-LDL對(duì)于體外培養(yǎng)HAECs Lox-1、TF及TFPI蛋白表達(dá)的影響，并觀察薤白對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷

15、的防治作用。 目的： （1）建立人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的模型； （2）觀察不同劑量濃度薤白超微粉抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促凝因子的作用及其機(jī)制。 方法： 為建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型，確定ox-LDL最終刺激濃度及刺激時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察不同濃度和不同時(shí)間ox-LDL刺激后，入主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Lox-1、TF及TFPI蛋白的表達(dá)變化，選定ox-LDL的最佳刺激

16、條件。 不同濃度的薤白超微粉預(yù)孵育12h后再加ox-LDL刺激，同時(shí)應(yīng)用Lox-1阻斷劑-Poly做對(duì)照組，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并且用western-blot方法檢測(cè)各組Lox-1、TF及TFPI的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論： （1）50ug/ml ox-LDL培養(yǎng)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24h顯著升高Lox-1蛋白表達(dá)水平，同時(shí)引起TF蛋白表達(dá)增強(qiáng)和TFPI蛋白的表達(dá)受到抑制，選為本實(shí)驗(yàn)的最佳刺激條件；