ATF3在腸癌細胞HCT116中生物學作用及蛋白酶體抑制劑Carfilzomib對ATF3的調節(jié).pdf

1、目的：全球范圍內，結直腸癌致死位居腫瘤死因第四位，盡管如今結直腸癌的診斷以及治療水平有所提高，其5年生存率也只有53.8-65.2％。ATF3蛋白屬于ATF/CREB轉錄因子家族成員具有堿性亮氨酸拉鏈結構（bZip）,作為一種轉錄活化因子在腫瘤中起著致癌基因還是抑癌基因作用存在爭論。本研究通過慢病毒介導ATF3在結直腸癌細胞HCT116中過表達，探討ATF3在HCT116細胞中對其增殖、腫瘤起始能力、轉移侵襲以及上皮間質轉化（EMT）生

2、物學作用，并初步探討可能的分子機制,探討蛋白酶體抑制劑Carfilzomib對HCT116的細胞毒作用以及對ATF3的調節(jié)。
　　方法：構建慢病毒介導的ATF3表達載體并感染HCT116，puro篩選出穩(wěn)定ATF3過表達的HCT116細胞株HCT116/ATF3和陰性對照HCT116/Control。應用MTS細胞活性分析、FACS細胞周期檢測、FACSAnexinⅤ-7-AAD、克隆形成實驗來檢測細胞增殖能力；應用細胞球囊形成實

3、驗以及FACS檢測細胞腫瘤起始能力；應用劃痕實驗、Transwell轉移分析和Transwell侵襲分析來檢測細胞轉移侵襲能力；應用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化鑒定細胞EM T；用Western Bloting和real-time qPCR來檢測相關基因的mRNA及蛋白表達情況。
　　結果：MTS細胞活性檢測增殖能力以及克隆形成實驗克隆數(shù)在HCT116/ATF3細胞明顯低于對照細胞HCT116/Control（p<0.05）；rea

4、l-time qPCR和Western Blot檢測到HCT116/ATF3細胞survivin、cyclinD1、PCNA表達下調以及PARP表達上調。HCT116/ATF3細胞形成的細胞球囊平均直徑和數(shù)量以及CD133+CD24+細胞群的百分比明顯低于對照細胞（p<0.05）；qRT-PCR和Western Bloting檢測到HCT116/ATF3細胞CD133、CD24、Ep-CAM、CD166、ID1、beta-catenin

5、和EZH2表達下調。HCT116/ATF3細胞創(chuàng)傷愈合劃痕實驗創(chuàng)傷愈合程度、Transwell遷移分析與Transwell侵襲實驗的細胞穿過數(shù)明顯低于對照細胞（p<0.05）；real-time qPCR和Western Blot檢測到HCT116/ATF3細胞MMP2和MMP9表達下調以及TIMP2和TIMP1表達上調。光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)HCT116/ATF3細胞形態(tài)由間質細胞向上皮細胞轉化（MET）；Western Blot檢測

6、到HCT116/ATF3細胞E-cadherin表達上調和snail、slug和twist表達下調。通過MTS細胞活性檢測HCT116生長隨Carfilzomib劑量增加而受到抑制，細胞周期檢測Carfilzomib作用后HCT116主要停滯在G0/G1期；FACSAnexinⅤ-7-AAD檢測HCT116凋亡隨Carfilzomib劑量增加而增加。通過real-time qPC R和Western Blot檢測到Carfilzomib

7、誘導ATF3表達具有時間依賴性。
　　結論：應用慢病毒介導基因轉染成功構建ATF3穩(wěn)定表達HCT116細胞模型HCT116/ATF3和對照細胞HCT116/Control；ATF3通過下調survivin、cyclinD1、PCNA以及上調PARP來抑制HCT116細胞增殖；ATF3通過下調CD133、CD24、Ep-CAM、CD166、ID1、beta-catenin和EZH2來抑制HCT116腫瘤起始能力；ATF3通過下調MM