乙內酰硫脲類和吡唑類雄激素受體拮抗劑的設計、合成及抗前列腺癌活性研究.pdf

1、目的:
　　前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著男性健康。我國是前列腺癌發(fā)病率和死亡率均較低的國家之一。但近年來，隨著我國人民生活水平的提高、飲食結構的改變及醫(yī)療診斷水平的提高，其發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長趨勢。
　　早期局限性PCa可以通過手術治療和放療完全治愈。對于非局限性、不能手術的PCa患者，根據(jù)PCa生長依賴于雄激素和雄激素受體(Androgen recepto

2、r，AR)信號通路的特性，通常采用雄激素去勢聯(lián)合應用雄激素受體拮抗劑的雄激素阻斷療法（Androgen deprivation therapy，ADT）進行治療。起初，ADT對大多數(shù)患者有效，但是經(jīng)過一段時間的治療后，患者會復發(fā)并進展為致命的去勢抵抗性前列腺癌(Castration resisitant PCa，CRPC)。CRPC對抗雄激素藥物治療耐受，這種現(xiàn)象在臨床上稱為“抗雄激素抵抗”。CRPC目前尚無有效的治療方法，其發(fā)生進展機

3、制也尚未闡明，但目前普遍認為其與AR信號通路的重新激活密切相關，因此，AR是治療前列腺癌的關鍵靶標。
　　本研究論文以前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程起關鍵作用的分子AR為靶點，基于AR配體結構域(Ligand Binding Domain，LBD)的晶體結構以及現(xiàn)有AR拮抗劑與AR LBD的作用模式，綜合運用藥物化學、化學生物學和計算機化學等藥物設計和發(fā)現(xiàn)策略，設計合成結構全新的AR拮抗劑做為抗前列腺癌候選藥物。
　　方法:
　

4、　首先，我們根據(jù)Me-too藥物的設計原則，對用于CRPC治療的第二代AR拮抗劑恩雜魯胺進行微小的結構改造，設計合成一系列乙內酰硫脲類衍生物。該類化合物的合成以2-取代對硝基苯甲酸和取代苯胺為原料，通過縮合反應、還原反應、strecker反應、及硫代乙內酰脲成環(huán)反應制備。該系列化合物的生物活性評價通過實時熒光定量PCR法、熒光素酶報告基因法和MTT法分別對其前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)表

5、達抑制活性、AR轉錄抑制活性和抗增殖活性進行測定。
　　由于目前臨床上應用的的AR拮抗劑都包含相同的結構片段，我們推測這可能與耐藥性的產(chǎn)生有關。為了尋找具有全新結構骨架的小分子AR拮抗劑，我們用計算機輔助藥物設計軟件SYBLE X1.1中的藥效團構建模塊GALAHAD以五個AR拮抗劑為模板構建3D藥效團，并用UNITY模塊產(chǎn)生藥效團模型3D提問式對商業(yè)化合物數(shù)據(jù)庫搜索，尋找符合藥效團模型特征的化合物，用Surflexdock模塊將

6、得到的化合物與野生型AR和突變型AR對接，將與兩個受體對接打分值都大于7的化合物進行結合模式分析，挑選出結合模式較好且能夠從商業(yè)途徑獲得的化合物。然后通過熒光偏振法、實時熒光定量PCR法和MTT法對虛擬篩選得到的化合物的AR親和力、PSA抑制活性和前列腺癌細胞生長抑制活性進行評價。
　　虛擬篩選過程中發(fā)現(xiàn)的化合物T3的PSA抑制活性較低，為了提高T3的AR轉錄抑制活性和抗增殖活性，我們對化合物T3進行了結構改造，通過對中間連接鏈和

7、兩端芳環(huán)不同取代基的考察，設計合成一系列吡唑衍生物進行構效關系研究。該類化合物的合成以取代苯乙酮為原料，經(jīng)克萊森縮合反應、吡唑成環(huán)反應、N-烷基化反應、水解反應、傅-克反應及縮合反應制備。通過實時熒光定量PCR法和MTT法對該類化合物的PSA表達抑制活性和抗增殖活性進行測定。
　　本論文合成的化合物結構通過核磁共振氫譜(1H-Nuclear Magnetic Resonance，1H-NMR)、核磁共振碳譜(13C-Nuclear

8、 Magnetic Resonance，13C-NMR)和高分辨質譜（High Resolution Mass Spectra，HRMS）等方法進行確證，并用高效液相色譜法（Hign Performance Liquid Chromatography，HPLC）進行了純度測定，RY-1型顯微熔點測定儀測定了目標化合物的熔點。經(jīng)查閱文獻證實，除個別化合物外所合成的目標化合物均為新化合物，未見文獻報道。
　　結果:
　　通過研究

9、乙內酰硫脲類衍生物對野生型和T877A突變型AR的拮抗激動活性和抗增殖活性，發(fā)現(xiàn)大部分的化合物與恩雜魯胺一樣，能夠選擇性抑制表達AR的LNCaP細胞的增殖，而對雄激素非依賴的PC-3細胞無作用。其中7t是活性最好的化合物，其對前列腺癌細胞LNCaP的生長抑制活性(GI50=1.78μM)較恩雜魯胺(GI50=23.58μM)提高了15倍?；衔?t表現(xiàn)出與恩雜魯胺相似的選擇性抑制LNCaP細胞生長的特點，然而其對AR的轉錄抑制活性較恩雜

10、魯胺有所下降，對去勢條件下LNCaP細胞生長抑制活性較恩雜魯胺高，說明化合物7t的作用機制可能與恩雜魯胺不同?；衔?i和7j對AR轉錄抑制活性和LNCaP細胞生長抑制活性較恩雜魯胺更高，它們同時對不表達AR的前列腺癌細胞PC-3也有很強的的抑制活性，說明化合物7i和7j可能通過AR依賴和AR非依賴雙重途徑發(fā)揮作用?；衔?j和7t可能在CRPC的治療中較恩雜魯胺有優(yōu)勢，其作用機制和成藥性值得進一步研究。
　　虛擬篩選過程中構建的

11、藥效團模型含有三個疏水性中心和三個氫鍵受體六個特征元素，與之前文獻報道的藥效團特征部分相符。通過對虛擬篩選得到的9個具有不同結構骨架的小分子的活性測試發(fā)現(xiàn)，9個小分子化合物均能與二氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)競爭性結合AR、抑制AR的轉錄活性，證明了我們基于藥效團和分子對接的虛擬篩選方案的可行性?；衔颰3、T4、T6和T8與MDV3100相似，均能夠選擇性抑制雄激素依賴的前列腺癌細胞LNCaP的生長，而對雄

12、激素非依賴的前列腺癌細胞PC-3無明顯影響。其中，化合物T3能夠與DHT競爭性結合AR，顯著抑制AR的轉錄活性，并且對雄激素依賴的前列腺癌細胞LNCaP的生長抑制活性(GI50=16.52μM)優(yōu)于MDV3100。化合物T3可以作為研究AR拮抗劑的先導化合物，進行進一步結構修飾。
　　通過對先導化合物T3的結構修飾，我們設計合成了吡唑-5-酮類衍生物和吡唑-5-甲酰胺類衍生物。我們對吡唑-5-甲酰胺類衍生物兩端苯環(huán)和吡唑1位N上的

13、取代基進行了考察，得到一系列吡唑-5-甲酰胺類衍生物。通過測試該類化合物對AR的轉錄抑制活性，總結吡唑-5-甲酰胺類衍生物的構效關系為:1)R1位上的取代基CF3,F＞Cl、Br和CH3;2）R2位上甲基或乙基取代對PSA的抑制活性無明顯影響;3）R4位單取代優(yōu)于R3或R5,R4位上單取代溴、氯、三氟甲基、氰基和硝基優(yōu)于乙炔基、氟和氫;當R4位為三氟甲基時，在R5位引入鹵素能夠提高化合物對PSA的抑制活性。
　　該類化合物中活性最

14、好的兩個化合物是H25和H43,與先導化合物T3相比:1)對PSA的抑制活性有所提高:H25和H43在10μM濃度下對PSA的抑制活性分別為100.00％和87.90％，而先導化合物T3和陽性對照藥恩雜魯胺分別為60.71％和96.79％;2)對LNCaP細胞的生長抑制活性提高了3-4倍:H25和H43的GI50分別為7.73和3.54μM，而先導化合物T3和比卡魯胺的GI50分別為16.52和23.11μM;3）能夠抑制雄激素非依賴性

15、前列腺癌細胞PC-3的生長。以上結果提示這些化合物可能通過AR依賴性和AR非依賴性雙重途徑發(fā)揮作用，具體作用機制有待進一步闡明。
　　結論及意義:
　　本研究論文以AR為靶點，基于AR LBD的晶體結構以及現(xiàn)有AR拮抗劑與AR LBD的相互作用模式，以恩雜魯胺為先導設計合成了一系列乙內酰硫脲衍生物;同時運用基于藥效團和分子對接的虛擬篩選策略發(fā)現(xiàn)了骨架結構全新的先導化合物T3,并對T3進行結構修飾設計合成了吡唑-5-酮類衍生物