乙內(nèi)酰硫脲類和吡唑類雄激素受體拮抗劑的設(shè)計、合成及抗前列腺癌活性研究.pdf

1、目的:
　　前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著男性健康。我國是前列腺癌發(fā)病率和死亡率均較低的國家之一。但近年來，隨著我國人民生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變及醫(yī)療診斷水平的提高，其發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長趨勢。
　　早期局限性PCa可以通過手術(shù)治療和放療完全治愈。對于非局限性、不能手術(shù)的PCa患者，根據(jù)PCa生長依賴于雄激素和雄激素受體(Androgen recepto

2、r，AR)信號通路的特性，通常采用雄激素去勢聯(lián)合應(yīng)用雄激素受體拮抗劑的雄激素阻斷療法（Androgen deprivation therapy，ADT）進(jìn)行治療。起初，ADT對大多數(shù)患者有效，但是經(jīng)過一段時間的治療后，患者會復(fù)發(fā)并進(jìn)展為致命的去勢抵抗性前列腺癌(Castration resisitant PCa，CRPC)。CRPC對抗雄激素藥物治療耐受，這種現(xiàn)象在臨床上稱為“抗雄激素抵抗”。CRPC目前尚無有效的治療方法，其發(fā)生進(jìn)展機(jī)

3、制也尚未闡明，但目前普遍認(rèn)為其與AR信號通路的重新激活密切相關(guān)，因此，AR是治療前列腺癌的關(guān)鍵靶標(biāo)。
　　本研究論文以前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程起關(guān)鍵作用的分子AR為靶點，基于AR配體結(jié)構(gòu)域(Ligand Binding Domain，LBD)的晶體結(jié)構(gòu)以及現(xiàn)有AR拮抗劑與AR LBD的作用模式，綜合運(yùn)用藥物化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)和計算機(jī)化學(xué)等藥物設(shè)計和發(fā)現(xiàn)策略，設(shè)計合成結(jié)構(gòu)全新的AR拮抗劑做為抗前列腺癌候選藥物。
　　方法:
　

4、　首先，我們根據(jù)Me-too藥物的設(shè)計原則，對用于CRPC治療的第二代AR拮抗劑恩雜魯胺進(jìn)行微小的結(jié)構(gòu)改造，設(shè)計合成一系列乙內(nèi)酰硫脲類衍生物。該類化合物的合成以2-取代對硝基苯甲酸和取代苯胺為原料，通過縮合反應(yīng)、還原反應(yīng)、strecker反應(yīng)、及硫代乙內(nèi)酰脲成環(huán)反應(yīng)制備。該系列化合物的生物活性評價通過實時熒光定量PCR法、熒光素酶報告基因法和MTT法分別對其前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)表

5、達(dá)抑制活性、AR轉(zhuǎn)錄抑制活性和抗增殖活性進(jìn)行測定。
　　由于目前臨床上應(yīng)用的的AR拮抗劑都包含相同的結(jié)構(gòu)片段，我們推測這可能與耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。為了尋找具有全新結(jié)構(gòu)骨架的小分子AR拮抗劑，我們用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計軟件SYBLE X1.1中的藥效團(tuán)構(gòu)建模塊GALAHAD以五個AR拮抗劑為模板構(gòu)建3D藥效團(tuán)，并用UNITY模塊產(chǎn)生藥效團(tuán)模型3D提問式對商業(yè)化合物數(shù)據(jù)庫搜索，尋找符合藥效團(tuán)模型特征的化合物，用Surflexdock模塊將

6、得到的化合物與野生型AR和突變型AR對接，將與兩個受體對接打分值都大于7的化合物進(jìn)行結(jié)合模式分析，挑選出結(jié)合模式較好且能夠從商業(yè)途徑獲得的化合物。然后通過熒光偏振法、實時熒光定量PCR法和MTT法對虛擬篩選得到的化合物的AR親和力、PSA抑制活性和前列腺癌細(xì)胞生長抑制活性進(jìn)行評價。
　　虛擬篩選過程中發(fā)現(xiàn)的化合物T3的PSA抑制活性較低，為了提高T3的AR轉(zhuǎn)錄抑制活性和抗增殖活性，我們對化合物T3進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，通過對中間連接鏈和

7、兩端芳環(huán)不同取代基的考察，設(shè)計合成一系列吡唑衍生物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究。該類化合物的合成以取代苯乙酮為原料，經(jīng)克萊森縮合反應(yīng)、吡唑成環(huán)反應(yīng)、N-烷基化反應(yīng)、水解反應(yīng)、傅-克反應(yīng)及縮合反應(yīng)制備。通過實時熒光定量PCR法和MTT法對該類化合物的PSA表達(dá)抑制活性和抗增殖活性進(jìn)行測定。
　　本論文合成的化合物結(jié)構(gòu)通過核磁共振氫譜(1H-Nuclear Magnetic Resonance，1H-NMR)、核磁共振碳譜(13C-Nuclear

8、 Magnetic Resonance，13C-NMR)和高分辨質(zhì)譜（High Resolution Mass Spectra，HRMS）等方法進(jìn)行確證，并用高效液相色譜法（Hign Performance Liquid Chromatography，HPLC）進(jìn)行了純度測定，RY-1型顯微熔點測定儀測定了目標(biāo)化合物的熔點。經(jīng)查閱文獻(xiàn)證實，除個別化合物外所合成的目標(biāo)化合物均為新化合物，未見文獻(xiàn)報道。
　　結(jié)果:
　　通過研究

9、乙內(nèi)酰硫脲類衍生物對野生型和T877A突變型AR的拮抗激動活性和抗增殖活性，發(fā)現(xiàn)大部分的化合物與恩雜魯胺一樣，能夠選擇性抑制表達(dá)AR的LNCaP細(xì)胞的增殖，而對雄激素非依賴的PC-3細(xì)胞無作用。其中7t是活性最好的化合物，其對前列腺癌細(xì)胞LNCaP的生長抑制活性(GI50=1.78μM)較恩雜魯胺(GI50=23.58μM)提高了15倍?；衔?t表現(xiàn)出與恩雜魯胺相似的選擇性抑制LNCaP細(xì)胞生長的特點，然而其對AR的轉(zhuǎn)錄抑制活性較恩雜

10、魯胺有所下降，對去勢條件下LNCaP細(xì)胞生長抑制活性較恩雜魯胺高，說明化合物7t的作用機(jī)制可能與恩雜魯胺不同?；衔?i和7j對AR轉(zhuǎn)錄抑制活性和LNCaP細(xì)胞生長抑制活性較恩雜魯胺更高，它們同時對不表達(dá)AR的前列腺癌細(xì)胞PC-3也有很強(qiáng)的的抑制活性，說明化合物7i和7j可能通過AR依賴和AR非依賴雙重途徑發(fā)揮作用?；衔?j和7t可能在CRPC的治療中較恩雜魯胺有優(yōu)勢，其作用機(jī)制和成藥性值得進(jìn)一步研究。
　　虛擬篩選過程中構(gòu)建的

11、藥效團(tuán)模型含有三個疏水性中心和三個氫鍵受體六個特征元素，與之前文獻(xiàn)報道的藥效團(tuán)特征部分相符。通過對虛擬篩選得到的9個具有不同結(jié)構(gòu)骨架的小分子的活性測試發(fā)現(xiàn)，9個小分子化合物均能與二氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)競爭性結(jié)合AR、抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性，證明了我們基于藥效團(tuán)和分子對接的虛擬篩選方案的可行性?；衔颰3、T4、T6和T8與MDV3100相似，均能夠選擇性抑制雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞LNCaP的生長，而對雄

12、激素非依賴的前列腺癌細(xì)胞PC-3無明顯影響。其中，化合物T3能夠與DHT競爭性結(jié)合AR，顯著抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性，并且對雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞LNCaP的生長抑制活性(GI50=16.52μM)優(yōu)于MDV3100?；衔颰3可以作為研究AR拮抗劑的先導(dǎo)化合物，進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾。
　　通過對先導(dǎo)化合物T3的結(jié)構(gòu)修飾，我們設(shè)計合成了吡唑-5-酮類衍生物和吡唑-5-甲酰胺類衍生物。我們對吡唑-5-甲酰胺類衍生物兩端苯環(huán)和吡唑1位N上的

13、取代基進(jìn)行了考察，得到一系列吡唑-5-甲酰胺類衍生物。通過測試該類化合物對AR的轉(zhuǎn)錄抑制活性，總結(jié)吡唑-5-甲酰胺類衍生物的構(gòu)效關(guān)系為:1)R1位上的取代基CF3,F＞Cl、Br和CH3;2）R2位上甲基或乙基取代對PSA的抑制活性無明顯影響;3）R4位單取代優(yōu)于R3或R5,R4位上單取代溴、氯、三氟甲基、氰基和硝基優(yōu)于乙炔基、氟和氫;當(dāng)R4位為三氟甲基時，在R5位引入鹵素能夠提高化合物對PSA的抑制活性。
　　該類化合物中活性最

14、好的兩個化合物是H25和H43,與先導(dǎo)化合物T3相比:1)對PSA的抑制活性有所提高:H25和H43在10μM濃度下對PSA的抑制活性分別為100.00％和87.90％，而先導(dǎo)化合物T3和陽性對照藥恩雜魯胺分別為60.71％和96.79％;2)對LNCaP細(xì)胞的生長抑制活性提高了3-4倍:H25和H43的GI50分別為7.73和3.54μM，而先導(dǎo)化合物T3和比卡魯胺的GI50分別為16.52和23.11μM;3）能夠抑制雄激素非依賴性

15、前列腺癌細(xì)胞PC-3的生長。以上結(jié)果提示這些化合物可能通過AR依賴性和AR非依賴性雙重途徑發(fā)揮作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。
　　結(jié)論及意義:
　　本研究論文以AR為靶點，基于AR LBD的晶體結(jié)構(gòu)以及現(xiàn)有AR拮抗劑與AR LBD的相互作用模式，以恩雜魯胺為先導(dǎo)設(shè)計合成了一系列乙內(nèi)酰硫脲衍生物;同時運(yùn)用基于藥效團(tuán)和分子對接的虛擬篩選策略發(fā)現(xiàn)了骨架結(jié)構(gòu)全新的先導(dǎo)化合物T3,并對T3進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾設(shè)計合成了吡唑-5-酮類衍生物