纈草萜內(nèi)酯對體外誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響.pdf

1、目的:通過FeNTA體外誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖的方法，觀察纈草萜內(nèi)酯A、B、C三種成分對肝星狀細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，從而探討該物質(zhì)在體外是否具有抗肝纖維化作用。
　　方法:1.增殖抑制實驗：采用體外實驗方法，將含3％小牛血清的DMEM傳代培養(yǎng)的HSC懸液接種于96孔板，1×104-100μl/孔，培養(yǎng)至近單層貼壁后吸出舊培養(yǎng)液（移液器不可接觸孔底），分別加入含3%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液（正常對照組）、含3%小牛血清的DMEM

2、培養(yǎng)液+0.1mmol/L FeNTA(模型組)、含3%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液+0.1mmol/L FeNTA+秋水仙堿0.5ug/ml（陽性對照組）、含3%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液+0.1mmol/L FeNTA+纈草萜內(nèi)酯A、B、C（50μg-100μg-200μg-300μg-400μg/ml）各五個濃度組（實驗組），每孔加藥量為10μl，每組設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)36h，棄上清后每孔均加入5mg/ml的MTT溶液20ul，37

3、℃，繼續(xù)孵育5小時，吸棄孔內(nèi)MTT液，每孔加入150μl DMSO，在微量振蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值（OD值），每孔重復(fù)測3次，記錄中位值，計算抑制率。
　　2.抗氧化實驗：將含3%小牛血清的DMEM傳代培養(yǎng)的HSC懸液接種于24孔板，5×105-500μl/孔，培養(yǎng)至近單層貼壁后吸出舊培養(yǎng)液，分別加入含3%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液（正常對照組）、含3%小牛血清的

4、DMEM培養(yǎng)液+0.1mmol/L FeNTA(模型組)、含3%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液+0.1mmol/LFeNTA+VitE50μmol/L（陽性對照組）、含3%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液+0.1mmol/L FeNTA+纈草萜內(nèi)酯A、B、C（50μg-200μg-400μg/ml）各三個濃度組（實驗組），每孔加藥量為20μl，每組平2孔，繼續(xù)培養(yǎng)36h后取上清液，根據(jù)試劑盒上實驗方法用紫外光分光光度計法測定各組SOD、MDA的吸光度

5、，再依據(jù)公式計算SOD活力及MDA含量。
　　結(jié)果:1.抑制增殖實驗：纈草萜內(nèi)酯A(400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml)， B(400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml、100μg/ml)，C(400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml)組與模型組差異有顯著性（P＜0.01），其他劑量組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）；纈草萜內(nèi)酯A400μg/ml組

6、、B（400μg/ml、300μg/ml）、C(400μg/ml、300μg/ml、200μg/ml)與陽性對照組比較差異有顯著性（P＜0.01），A300μg/ml組及B200μg/ml組與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），余各組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；模型組與空白對照組比較差異具有顯著性（P＜0.01）。
　　2.抗氧化實驗：
　　2.1.SOD活力：纈草萜內(nèi)酯A、B、C各組的SOD活

7、力均高于模型組，其中A400μg/ml組、B（400μg/ml、200μg/ml）、C（400μg/ml、200μg/ml）與模型組差異具有顯著性（P＜0.01），A200μg/ml組、C50μg/ml組與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而A50μg/ml組、B50μg/ml組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明除A50μg/ml組、B50μg/ml組外的各組均有一定的抗氧化作用；纈草萜內(nèi)酯C400μg/ml組的SOD

8、活力高于陽性對照組，二者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＜0.01），余各組均低于陽性對照組，差異均有顯著性（P＜0.01），表明C400μg/ml組抗氧化作用強于維生素E組，而其余各組作用均不及維生素E組。
　　2.2.MDA含量：纈草萜內(nèi)酯A、B、C各組的MDA含量均小于模型組，其中A50μg/ml組、B50μg/ml組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），C50μg/ml組與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），余各組與模

9、型組差異有顯著性（P＜0.01），表明除A50μg/ml組、B50μg/ml組外的各組均有一定的抗氧化作用；纈草萜內(nèi)酯B400μg/ml組及C400μg/ml組的MDA含量低于陽性對照組，其中B400μg/ml組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），C400μg/ml組與陽性對照組差異有顯著性（P＜0.01），余各組MDA含量均高于陽性對照組，A400μg/ml組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），余各組與陽性對照組差

10、異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明C400μg/ml組抗氧化作用強于維生素E50μmol/L濃度組，A400μg/ml組、B400μg/ml組抗氧化作用可能與維生素E組相當(dāng)，而其余各組作用均不及維生素E組。
　　結(jié)論:1.纈草萜內(nèi)酯A、B、C不同濃度對次氮基三醋酸鐵誘導(dǎo)的HSC增殖均有不同程度的抑制作用，且存在一定劑量依賴趨勢，即隨著藥物作用濃度增加，抑制作用越強。從三種成分的抑制率來看，C的抑制效果最強，B次之，A作用最弱。<

11、br>　　2.纈草萜內(nèi)酯A、B、C在不同濃度(A50μg/ml、B50μg/ml組除外)均有一定抗氧化應(yīng)激的作用。當(dāng)給予不同濃度A、B、C后，MDA的水平降低，而SOD水平升高，且存在一定劑量依賴趨勢，隨著藥物濃度的增加，SOD活力逐漸升高，MDA含量逐漸下降。
　　3.纈草萜內(nèi)酯A、B、C相同濃度比較，C成分的抗氧化作用明顯強于A、B，而B成分作用稍強于A，但在50μg/ml組時A、B、C三種成分抗氧化作用無明顯差異。