甲基蓮心堿對TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖及gremlin表達的影響.pdf

1、背景與目的:
　　 肝纖維化(Hepatic fibrosis)是各種致病因子導致的彌漫性肝內細胞外基質(extra cellularmatrix，ECM)過度沉積的病理過程[1]。包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝病等在內的大部分肝病都可能導致肝纖維化，可進一步進展為肝硬化甚至肝癌，為人民的健康和國家的經(jīng)濟發(fā)展帶來沉重負擔。近年來，研究發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿(neferine，Nef)作為中藥蓮子芯的重要有效成

2、分，具有著實的抗纖維化作用。本實驗通過觀察甲基蓮心堿對轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導的肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)增殖及gremlin表達的影響，初步探討甲基蓮心堿可能的抗纖維化作用機制。
　　 方法:
　　 1、細胞培養(yǎng)與分組體外培養(yǎng)HSC-T6細胞，分成5組，正常對照組加入含10％胎牛血清(fetalbovine

3、serum，F(xiàn)BS)的H-DMEM; TGF-β1干預組加入含10％FBS的H-DMEM和終濃度為5ng/mL的重組人TGF-β1;TGF-β1+甲基蓮心堿聯(lián)合干預組加入終濃度為5ng/mL的重組人TGF-β1，并按終濃度為2.0、4.0和8.0mmol/L分別加入甲基蓮心堿工作液。
　　 2、CCK8法檢測細胞增殖抑制率將HSC-T6細胞按1.0×105/mL接種于96孔板，待細胞生長至70％融合時，換含0.25％的FBS血清

4、培養(yǎng)液作用24 h，按分組條件加入干預因素，再分別培養(yǎng)24、48和72h，各組加入CCK-8試劑液，在酶標儀450nm波長測各孔吸光度（A）值，并計算抑制率。
　　 3、檢測gremlin、TGF-β1、α-SMA mRNA及蛋白表達將HSC-T6細胞按1.0×105/mL接種于6孔板，待細胞生長至70％融合時換含0.25％的FBS血清培養(yǎng)液作用24 h，再按分組條件加入干預因素作用48h。半定量RT-PCR、Western印跡

5、法分別檢測HSC-T6細胞gremlin、TGF-β1、α平滑肌動蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA) mRNA及蛋白表達。
　　 4、統(tǒng)計學分析組間差異采用單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett's T3檢驗，相關性采用Pearson直線相關分析。
　　 結果:
　　 1、甲基蓮心堿抑制TGF-β1誘導的HSC-T6細胞增殖與正常對照組比較，TGF

6、-β1干預組HSC-T6細胞增殖差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。甲基蓮心堿能抑制細胞增殖，呈時間、濃度依賴性。以TGF-β1+甲基蓮心堿8mmol/L聯(lián)合作用72h對HSC-T6細胞抑制最顯著(P＜0.001)，抑制率為(69.08±1.05)％。不同濃度甲基蓮心堿干預組與TGF-β1干預組比較，HSC-T6細胞增殖受到明顯抑制(均P＜0.01)，并呈時間依賴性;與TGF-β1+2.0mmol/L甲基蓮心堿組比較，TGF-β1+4

7、.0mmol/L甲基蓮心堿組細胞抑制更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01);與TGF-β1+4.0mmol/L甲基蓮心堿組比較，TGF-β1+8.0 mmol/L甲基蓮心堿組細胞抑制更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。
　　 2、甲基蓮心堿能下調TGF-β1誘導的HSC-T6中gremlin、TGF-β1、α-SMA mRNA的表達半定量RT-PCR結果顯示，TGF-β1干預組HSC-T6細

8、胞gremlin、TGF-β1、α-SMA mRNA相對含量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）;TGF-β1+不同濃度甲基蓮心堿干預組與TGF-β1干預組比較，gremlin、TGF-β1、α-SMA mRNA表達逐漸減少(均P＜0.05)。與TGF-β1+2.0mmol/L甲基蓮心堿組比較，TGF-β1+4.0 mmol/L甲基蓮心堿組gremlin、TGF-β1、α-SMA mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P

9、＜0.05）;與TGF-β1+4.0 mmol/L甲基蓮心堿組比較，TGF-β1+8.0mmol/L甲基蓮心堿組gremlin、TGF-β1、α-SMAmRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。
　　 3、甲基蓮心堿能下調TGF-β1誘導的HSC-T6細胞中gremlin、TGF-β1、α-SMA蛋白的表達Western印跡法結果顯示，TGF-β1干預組HSC-T6細胞gremlin、TGF-β1、a-SMA蛋白相對

10、含量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.005）;TGF-β1+不同濃度甲基蓮心堿干預后，gremlin、TGF-β1、a-SMA蛋白表達逐漸減少（均P＜0.05）。與TGF-β1+2.0mmol/L甲基蓮心堿組比較，TGF-β1+4.0mmol/L甲基蓮心堿組gremlin、TGF-β1、a-SMA蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）;與TGF-β1+4.0mmol/L甲基蓮心堿組比較，TGF-β1+8.0mmo

11、l/L甲基蓮心堿組gremlin、TGF-β1、a-SMA蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。
　　 4、gremlin、TGF-β1、α-SMA的表達呈兩兩正相關相關性分析結果顯示，各組gremlin mRNA及蛋白表達與TGF-β1表達呈正相關(rs=0.880，rs=0.804，P＜0.05)，TGF-β1 mRNA及蛋白表達與a-SMA表達呈正相關（rs=0.883，rs=0.878，P＜0.05），gre

12、mlin mRNA及蛋白表達與a-SMA呈正相關（rs=0.863，rs=0.818，P＜0.05）。
　　 結論:
　　 1、gremlin、TGF-β1、a-SMA在各組HSC-T6細胞中均有表達。
　　 2、TGF-β1對HSC-T6細胞增殖無影響，但可上調TGF-β、gremlin、a-SMA的mRNA及蛋白表達。
　　 3、gremlin、TGF-β1、a-SMA的表達呈兩兩正相關。