姜黃素對血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞增殖及氧化應激的影響.pdf

1、目的：近年來伴隨生活方式的改變，動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)病率逐年上升，已成為引發(fā)心腦血管疾病如心肌梗死、腦血管病和周圍血管病共同的病理基礎，也是引起發(fā)病率和死亡率增高的常見原因。血管平滑肌細胞(VSMCs)是構(gòu)成血管壁的重要組成成分，在AS的整個病理變化中都起了作用。因此探討調(diào)節(jié)VSMCs生理病理功能，對防治AS具有重要意義。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的主要肽類激素，可誘導VSMCs的增殖及遷移

2、，目前已成為誘導各種心血管疾病病理基礎的主要刺激因素之一。由此可見，抑制AngⅡ誘導VSMCs過度增殖可作為一個治療AS的重要靶點。研究表明，氧化應激（OS）是AS發(fā)生發(fā)展過程中重要促進因素之一。OS是指機體在遭受各種有害刺激時，組織內(nèi)部活性氧族（ROS）和活性氮自由基（RNS）的生成速率大于清除速率導致體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡進而發(fā)生一系列氧化應激損傷。ROS是機體正常代謝所必需的，當 ROS的生成大于清除時，過多的ROS堆積會直接損

3、害細胞功能，損傷血管內(nèi)皮細胞功能并誘導VSMCs遷移、增殖和基質(zhì)成分過表達加重AS病變進展；RNS主要包括一氧化氮（NO）、過氧化亞硝酸鹽（ONOO-）等。生物體內(nèi)本身具有許多抗氧化防御劑，目前已證實至少有三大抗氧化酶家族主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Gpx）和過氧化氫酶（CAT），其主要用于保護機體免受氧化應激損傷。因此，抗氧化藥物在治療AS中起著重要作用。姜黃素（Cur）是從姜科草本植物姜黃根莖中提取的一種天

4、然多酚類物質(zhì)，具有廣泛的藥理作用。姜黃的研究歷史悠久，其味辛、苦、性溫，入肝脾二經(jīng)，是一味常用的中藥，而 Cur作為姜黃的主要活性成分，發(fā)現(xiàn)具有抗增殖、抗氧化、清除氧自由基、抗炎、降血脂、抗癌等多種藥理學作用，且具有顯著的心血管保護活性。近年來流行病學調(diào)查顯示：Cur的攝入量與AS的發(fā)病呈負相關(guān)。本實驗旨在觀察Cur對AngⅡ誘導的VSMCs增殖及氧化應激反應的影響，以期為Cur抗AS的臨床應用提供實驗依據(jù)。以大鼠主動脈分離后原代培養(yǎng)的

5、VSMC為研究對象，在AngⅡ刺激誘導下，運用現(xiàn)代生物學技術(shù)，如噻唑藍（MTT法）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，RT-PCR）、蛋白印跡法（Western blot）等，觀察Cur對AngⅡ誘導VSMCs增殖及氧化應激的影響以期為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠VSMCs細胞，MTT法測定不同濃度Cur對AngⅡ誘導VSMCs增殖

6、的影響。并分別設對照組、AngⅡ干預組、20μmol/L Cur組及AngⅡ聯(lián)用不同濃度Cur（5、10、20μmol/L）組，實時定量PCR和Western blot測定各組細胞誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、p47phox mRNA與蛋白的表達。亞硝酸鹽含量重氮化反應吸光測定法（Greiss assay）測定細胞內(nèi)一氧化氮（NO）的表達。DCFH-DA氧化法測定細胞內(nèi)ROS含量。黃嘌呤氧化酶法檢測各試驗組細胞上清液中SOD活性，采用

7、分光光度計測定Gpx活性。采用p47phox特異性siRNA干擾VSMCs p47phox的表達，并深入探討Cur抑制AngⅡ誘導的VSMCs增殖及氧化應激的機制。
　　結(jié)果：⑴給予10-7mol/L AngⅡ刺激VSMCs72h，VSMCs增殖增強，相比給予不同濃度的Cur預處理1 h，可觀察到細胞增殖受到抑制且表現(xiàn)出劑量依賴性。⑵RT-PCR與Western blot檢測分析VSMCs iNOS和p47phox mRNA及蛋白

8、表達：給予VSMCs10-7mol/L AngⅡ刺激3 h，iNOS和p47phoxmRNA及蛋白表達水平升高（P＜0.01）；使用不同濃度Cur預處理1 h，再給予同濃度AngⅡ刺激3 h，iNOS和p47phox mRNA及蛋白表達水平下調(diào)并隨著Cur濃度的增加其iNOS和p47phox mRNA及蛋白表達水平呈逐漸下降的趨勢（P<0.05）。⑶Cur對AngⅡ誘導的VSMCs細胞內(nèi)ROS表達以及SOD、Gpx活性的影響：給予VSM

9、Cs10-7mol/L AngⅡ刺激24h后，VSMCs細胞內(nèi)ROS含量升高，SOD及Gpx活性明顯降低；給予不同濃度Cur預處理1h，能夠有效抑制AngⅡ誘導VSMCs細胞內(nèi)ROS合成，并且發(fā)現(xiàn)SOD及Gpx活性升高，且呈濃度依賴性（P<0.05）。⑷本實驗已證明，Cur能夠濃度依賴性下調(diào)AngⅡ誘導的VSMCs內(nèi)p47phox蛋白和mRNA的表達（P<0.05）。進一步用p47phox特異性siRNA下調(diào)p47phox表達，結(jié)果顯示

10、，伴隨p47phox的蛋白和mRNA表達水平降低，VSMCs細胞內(nèi)ROS生成亦減少。證明，Cur可通過下調(diào)p47phox表達抑制ROS的產(chǎn)生從而發(fā)揮其抗氧化作用。
　　結(jié)論：①Cur能夠有效抑制AngⅡ誘導的VSMCs的增殖，且這種抑制作用呈濃度依賴性。②Cur可抑制AngⅡ誘導的VSMCs iNOS基因表達及NO產(chǎn)量，并呈濃度依賴性；Cur濃度越高，iNOS基因表達及NO產(chǎn)量越低。③Cur可逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導的VSMCs內(nèi)SOD、