冰片與抗菌藥物體內(nèi)外聯(lián)合抗菌作用的研究.pdf

1、自青霉素問世以來，抗菌藥物逐漸占據(jù)臨床抗感染市場(chǎng)。它猶如一把雙刃劍，一方面為人類的健康事業(yè)保駕護(hù)航，挽救了無數(shù)鮮活的生命；另一方面，由于抗菌藥物的不合理使用導(dǎo)致耐藥菌的蔓延，引發(fā)了一系列嚴(yán)重的后果，如超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生、藥害事件頻發(fā)等，細(xì)菌耐藥性已引起全球醫(yī)療領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。因此，為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)應(yīng)用戰(zhàn)略，加強(qiáng)抗菌藥物應(yīng)用監(jiān)管體系、開發(fā)新型抗菌制劑逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性勢(shì)在必行。
　　近年來，隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)中藥資源的廣泛和深入研究，其逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性

2、的作用逐漸引起關(guān)注。在其系統(tǒng)的理論指導(dǎo)下，已有大量實(shí)踐表明中藥復(fù)方在抗菌、延緩甚至消除細(xì)菌耐藥性方面極具優(yōu)勢(shì)，這為開發(fā)新型抗菌藥物提供了可能。
　　冰片（Borneol）亦稱龍腦、梅花冰片等，分為天然冰片與合成冰片，前者由龍腦香科植物龍腦香Dryobalanops aromatica Gaertnf.樹脂或菊科植物艾納香Blumea balsamifera DC.葉片中提取而得；后者又稱機(jī)制冰片，以樟腦或者松節(jié)油等材料化學(xué)合成。冰

3、片成分復(fù)雜，因來源而異，作用廣泛，《本草衍義》記載冰片“獨(dú)行則勢(shì)弱，佐使則有功”，自古用以開竅醒神。此外，冰片可雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高生物利用度、抗菌抗炎抗病毒及逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥等.據(jù)報(bào)道，冰片對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙性溶血性鏈球菌等表現(xiàn)出明顯的抗菌效果，低濃度抑菌，高濃度具有殺菌作用。冰片還可促進(jìn)慶大霉素的吸收，增加其中樞和血液濃度，但未見其聯(lián)用對(duì)臨床常見致病菌的抗菌效果，市場(chǎng)上也未有復(fù)方制劑出現(xiàn)。因此本文就冰片和抗菌藥物

4、聯(lián)用對(duì)臨床常見致病菌的抗菌效果進(jìn)行探討。
　　本課題以冰片與臨床常用抗菌藥物為研究對(duì)象，考察了兩者聯(lián)用對(duì)臨床分離的4種致病菌株（來源于廣東省中醫(yī)院大德路總院住院部檢驗(yàn)科）—金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷氏菌、銅綠假單胞菌的體內(nèi)外聯(lián)合抗菌效果。采用光電比濁計(jì)數(shù)法定量菌液濃度；以K-B紙片法考察細(xì)菌耐藥性獲得耐藥菌株；以不同方法測(cè)定兩者體外聯(lián)合抗菌效果，篩選出具協(xié)同作用的組合，并初步探討最佳配比為體內(nèi)研究提供前提；建立敗血癥模型

5、考察體內(nèi)聯(lián)合抗菌作用，為后續(xù)研究提供依據(jù)。
　?。?）采用光電比濁計(jì)數(shù)法定量菌懸液濃度。以紫外分光光度法測(cè)定菌懸液吸光度A，同時(shí)以涂板計(jì)數(shù)法測(cè)定稀釋后的菌懸液的菌落形成單位數(shù)cfu，繪制A-cfu標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度定量菌懸液濃度。結(jié)果表明，4種試驗(yàn)菌株的A-cfu曲線分別是：金黃色葡萄球菌y=(297.68x-56.990)×107，R2=0.9988；大腸埃希菌y=(528.15x-133.37)×106，R2=0.9978；

6、銅綠假單胞菌y=(321.85x-45.411)×107，R2=0.9966；肺炎克雷氏菌y=(257.63x-0.4971)×106，R2=0.9986，其中x為吸光度A，y為菌落形成單位數(shù)cfu，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性均良好。
　?。?）采用K-B紙片法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),測(cè)定臨床常用抗菌藥物藥敏紙片對(duì)待測(cè)菌株抑菌圈直徑的大小，參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI2010版）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)判定待測(cè)菌株的藥物敏感性。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌

7、（編號(hào)13583）為耐甲氧西林的菌株，對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類抗生素、部分磺胺類抗生素表現(xiàn)出明顯的耐藥性；大腸埃希菌（編號(hào)13920）對(duì)所有頭孢類、多數(shù)青霉素類、氨曲南和部分磺胺類抗生素耐藥；銅綠假單胞菌（編號(hào)13930）對(duì)部分磺胺類抗生素具有明顯耐藥性，對(duì)第三、四代頭孢類抗生素亦有較高耐藥性；肺炎克雷氏菌（編號(hào)13952）對(duì)多數(shù)抗菌藥物產(chǎn)生明顯的耐藥性，其中對(duì)所有頭孢類、多數(shù)青霉素類、氨曲南明顯耐藥，此菌株可能產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。

8、　?。?）研究冰片與抗菌藥物體外聯(lián)合抗菌作用，篩選出具協(xié)同抗菌效果的組合并考察兩者最佳配比，為體內(nèi)研究提供理論基礎(chǔ)。采用試管二倍稀釋法分別考察冰片和臨床常用抗菌藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的單獨(dú)抗菌作用，測(cè)定其最低抑菌濃度（MIC）；再采用微量棋盤法考察冰片與抗菌藥物聯(lián)合抗菌效果，測(cè)定聯(lián)合給藥時(shí)兩者的MIC；最后計(jì)算其FIC指數(shù)，F(xiàn)IC=MIC甲藥聯(lián)用／MIC甲藥單用＋MIC乙藥聯(lián)用／MIC乙藥單用，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用；＞0.

9、5～1為相加作用；＞1～2為無關(guān)作用；＞2為拮抗作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冰片與9種常用抗菌藥物對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌（編號(hào)13583）的聯(lián)合抗菌效果中5種組合表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用，4種表現(xiàn)出相加作用，未出現(xiàn)拮抗作用；對(duì)耐藥大腸埃希菌（編號(hào)13920）的聯(lián)合抗菌效果中7種組合表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用，1種表現(xiàn)出相加作用，1種為無關(guān)作用，均未出現(xiàn)拮抗作用；對(duì)耐藥銅綠假單胞菌（編號(hào)13930）的聯(lián)合抗菌效果中6種組合為協(xié)同抗菌作用，1種為相加作用，2種為無

10、關(guān)作用，均未出現(xiàn)拮抗作用；對(duì)耐藥肺炎克雷氏菌（編號(hào)13952）的聯(lián)合抗菌效果中5種組合表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用，2種表現(xiàn)出相加作用，2種為無關(guān)作用，均未出現(xiàn)拮抗作用。結(jié)果提示冰片與部分抗菌藥物聯(lián)合使用抗耐藥金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷氏菌感染時(shí)可提高抗菌藥物的抗菌效果。不同配比慶大霉素∕冰片、左氧氟沙星∕冰片、頭孢他啶∕冰片聯(lián)用時(shí)最低抑菌濃度MIC較抗菌藥物單劑均明顯降低，其中兩者配比為4:1時(shí)最為明顯，提示抗菌藥物∕冰

11、片配比4:1時(shí)體外抗菌作用最佳。
　　（4）考察冰片與抗菌藥物體內(nèi)聯(lián)合抗菌作用，尋找最佳配比組方，為機(jī)理研究、臨床試驗(yàn)以及新型抗耐藥復(fù)方制劑的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。昆明小鼠（體質(zhì)量18-22g）按體重隨機(jī)分組，雌雄各半。腹腔注射0.5mL5％高活性干酵母配制的1MLD菌液建立敗血癥模型，即刻灌胃0.2mL不同配比系列藥液，觀察并記錄各組給藥后12、24、36、72h至7d內(nèi)的小鼠表觀癥狀和存亡率。按Bliss法計(jì)算小鼠對(duì)感染菌的藥物半

12、數(shù)有效量ED50和95%可信限。左氧氟沙星與冰片體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，左氧氟沙星單劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷氏菌感染小鼠建立敗血癥模型的半數(shù)有效量ED50分別為54.1、51.6、50.0、53.2㎎∕㎏。冰片單劑的半數(shù)有效量ED50分別為749.9、650.5、632.8、683.1㎎∕kg。分別以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷氏菌感染小鼠建立敗血癥模型，不同配比左氧氟沙星∕冰片（1:1

13、、2:1、4:1、8:1）合用的ED50值較左氧氟沙星單劑ED50值顯著降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，均存在顯著性差異（P＜0.05）。頭孢他啶與冰片體內(nèi)聯(lián)合抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，頭孢他啶單劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷氏菌感染小鼠建立敗血癥模型的半數(shù)有效量ED50分別為944.7、975.0、882.1、1000.3㎎∕㎏；不同配比頭孢他啶∕冰片（1:1、2:1、4:1、8:1）合用的ED50值較頭孢他啶單劑ED50值顯著降