IGF1R基因沉默對(duì)梅花鹿鹿茸軟骨細(xì)胞增殖周期凋亡等作用研究.pdf

1、鹿茸是梅花鹿第二顯著性征，具有周期性再生的特性。在它生長(zhǎng)最旺盛時(shí)期，其生長(zhǎng)速度可達(dá)到2cm/d。已有的研究表明:鹿茸的再生是一個(gè)基于鹿茸干細(xì)胞代謝且受多種因子調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，此外有大量研究報(bào)道IGF1R基因參與多種細(xì)胞的增殖與代謝。然而，IGF1R基因在鹿茸軟骨細(xì)胞的研究鮮有報(bào)道，因此本試驗(yàn)旨在從鹿茸軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、周期和凋亡的角度探究IGF1R的功能，為進(jìn)一步深入研究鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)理提供新的觀點(diǎn)。本試驗(yàn)采用RNAi技術(shù)干擾鹿茸

2、軟骨細(xì)胞IGF1RmRNA的表達(dá)，從不同角度分析其對(duì)軟骨細(xì)胞的影響。
　　本研究以RNAi-Ready pSIREN-RetroQZsGreen plasmid為載體，以IGF1R作為候選基因研究其對(duì)鹿茸軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制，成功構(gòu)建了2個(gè)RNAi重組質(zhì)粒，分別命名為p shRNA-1和pshRNA-2，用于轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞。利用Real-Time PCR和Western blot技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)染48h后的RNAi效果進(jìn)行分析。研究IG

3、F1R對(duì)鹿茸軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及自身mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)一步探討鹿茸生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞48h，相比陰性對(duì)照組，軟骨細(xì)胞經(jīng)pshRNA-1和pshRNA-2處理，IGF1R基因mRNA表達(dá)量分別為51％和75％;蛋白質(zhì)的表達(dá)量也有明顯下降。表明干擾細(xì)胞效果明顯。
　　(2)采用CCK-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后細(xì)胞增殖情況。相比于陰性對(duì)照組，試驗(yàn)組的細(xì)胞增殖呈下降趨勢(shì)

4、，尤其是pshRNA-1質(zhì)粒干擾效果明顯((1.09士0.10 vs1.16士0.09(P＜0.01),1.04土0.02 vs1.10±0.06(P＜0.05),0.79±0.06 vs1.01±0.07(P＜0.01))。
　　(3)轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞48h，相比于陰性對(duì)照組pshRNA-negative，試驗(yàn)組細(xì)胞更多的處于G1期（79.47±0.11vs82.27±0.35（P＜0.01）），而S期細(xì)胞數(shù)量顯著下降(16.56±

5、0.10 vs14.82±0.014(P＜0.05))。
　　(4)轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞48h后，試驗(yàn)組pshRNA-1和陰性對(duì)照組pshRNA-negative的早期凋亡水平分別為(22.12±2.72％ vs8.56±0.16％，P＜0.01);正?；罴?xì)胞分別為（62.85±5.97 vs77.39士4.46，P＜0.05）。相關(guān)凋亡基因p53(P＜0.01)、bcl-2(P＜0.05)和bax的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01)。表明