microRNA-455-5p靶向IGF1R調(diào)控豬脂肪細(xì)胞增殖分化機(jī)理的研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一種調(diào)節(jié)性的非編碼小分子RNA，主要通過轉(zhuǎn)錄水平在各項生命活動中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。許多研究表明microRNA-455-5p可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但未見有關(guān)miR-455-5p調(diào)控脂肪細(xì)胞增殖分化的研究報道。本文以廣西巴馬小型豬和長白豬的背部皮下脂肪組織為研究對象，用qRT-PCR技術(shù)檢測microRNA-455-5p和IGF1R在皮下脂肪中的表達(dá)譜，通過雙熒光素酶報告基因檢測、qRT-PCR、Wes

2、tern blotting等方法，探究miR-455-5p在豬脂肪組織增殖分化中的作用。主要研究結(jié)果如下:1.預(yù)測到IGF1R基因是miRNA-455-5p的一個潛在靶基因。2.廣西巴馬小型豬和長白豬miRNA-455-5p與IGF1R基因在4個不同日齡脂肪組織中的表達(dá)結(jié)果顯示:(1)廣西巴馬小型豬脂肪中miR-455-5p的表達(dá)水平都隨著月齡的增長而不斷上升，在4、5月齡時，miRNA-455-5p的表達(dá)量顯著高于3月齡(P＜0.05

3、)，在6月齡時達(dá)到最高表達(dá)水平。在長白豬的脂肪組織中，miRN-455-5p的表達(dá)與巴馬小型豬相似，隨月齡的增加而呈現(xiàn)上升趨勢，但是在6月齡的時候開始顯著下調(diào)(P＜0.05)。(2)廣西巴馬小型豬和長白豬中IGF1R mRNA的表達(dá)水平均隨月齡的增長而不斷降低。此外，miR-455-5p在不同組織中均有表達(dá)，在廣西巴馬小型豬的心臟和肌肉中有高豐度的表達(dá)，在脾、脂肪和肝臟中有中等豐度表達(dá)，在腦組織中表達(dá)量最低;在長白豬的心臟和肌肉中有高豐

4、度的表達(dá)，在脾和脂肪組織有中等豐度表達(dá)，在腦和肝臟組織中表達(dá)量最低。3.構(gòu)建了pLV-miRNA-455-5p慢病毒載體并轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞，qRT-PCR檢測結(jié)果表明過表達(dá)成功。應(yīng)用常規(guī)的PCR技術(shù)和橋聯(lián)PCR技術(shù)分別克隆獲得含有miRNA-455-5p結(jié)合位點的IGF1R3'UTR片段及突變掉miRNA-455-5p結(jié)合位點的IGF1R3'UTR片段，把這兩個片段分別插入到psi-CHECKTM-2載體，構(gòu)建靶標(biāo)正常載體IGF1R

5、-WT和靶標(biāo)突變載體IGF1R-MUT，同時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。結(jié)果表明miWT組的熒光值極顯著的低于其它各組(P＜0.01)，而miNC、miMUT和inWT三組之間無顯著差異(P＜0.05);WT組的熒光值極顯著低于MUT組和NC組(P＜0.01)，而MUT組和NC組間無顯著差異(P＞0.05)。這些結(jié)果表明IGF1R基因為miRNA-455-5p的一個靶基因，靶標(biāo)位點為IGF1R基因3

6、'UTR的突變位點。5.探索了3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中miRNA-455-5p、IGF1R、PPARγ和C/EBPα的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示miR-455-5p和成脂標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα的表達(dá)水平均隨細(xì)胞誘導(dǎo)分化進(jìn)程而逐漸上調(diào)，但miR-455-5p在誘導(dǎo)分化第8d出現(xiàn)顯著下調(diào)(P＜0.05);IGF1R出現(xiàn)與miR-455-5p相反的表達(dá)趨勢。過表達(dá)和抑制miRNA-455-5p實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-455-5pmi

7、mic的細(xì)胞，與對照組相比，miR-455-5p的表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01);細(xì)胞中PPARγ和C/EBPα的表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染miR-455-5p inhibitor的細(xì)胞，miR-455-5p的表達(dá)量極顯著低于對照組(P＜0.01)，脂肪分化標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα的表達(dá)量均顯著上調(diào)(P＜0.05)。用miR-455-5p inhibitor和miR-455-5p mimic分別轉(zhuǎn)染小鼠前體脂肪細(xì)胞3T

8、3-L1，測定細(xì)胞IGF1R基因與miR-455-5p的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-455-5p inhibitor、mi-455-5p mimic及3T3-L1細(xì)胞，IGF1R的mRNA水平均沒有顯著變化(P＞0.05)。Western blotting結(jié)果表明miR-455-5p inhibitor組的IGF1R蛋白表達(dá)量極顯著高于inhib itor NC組;而miR-455-5p mimic組的IGF1R蛋白表達(dá)量極顯著低于m