TNFR1基因沉默對(duì)氧氟沙星和麻保沙星誘導(dǎo)的幼齡犬軟骨細(xì)胞早期凋亡的影響.pdf

1、喹諾酮類(Quinolones，QNs)藥物是一類具有抗菌譜廣、活性極高、生物利用度高、價(jià)格便宜、耐藥突變概率低且極少產(chǎn)生交叉耐藥性的人工合成抗生素，由于作用明顯且優(yōu)點(diǎn)諸多而被廣泛應(yīng)用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)，QNs有可能使幼齡動(dòng)物（尤其是犬）表現(xiàn)出跛行、關(guān)節(jié)損傷等軟骨毒性癥狀，其臨床應(yīng)用也因此被局限。目前，QNs導(dǎo)致的軟骨毒性還沒有被闡明。研究發(fā)現(xiàn)死亡受體途徑中的TNFR信號(hào)通路相關(guān)基因在QNs作用于軟骨細(xì)胞早期均有不同程度的表達(dá)，其是否參與

2、QNs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，需進(jìn)一步研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)采用siRNA阻斷軟骨細(xì)胞TNFR1基因表達(dá)探究TNFR信號(hào)通路是否參與了QNs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的早期凋亡。
　　取幼齡犬軟骨，采用Ⅱ型膠原酶消化法分離軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代。分別使用100μg/mL麻保沙星和氧氟沙星處理軟骨細(xì)胞2h、8h和24h。采用MTT比色法及流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)軟骨細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的活性及凋亡率;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)軟骨細(xì)胞TNFR信號(hào)通路中關(guān)鍵因子TNF-

3、α、TNFR1、TRADD、FADD和Caspase-8的各時(shí)間點(diǎn)mRNA表達(dá)水平;Western Blot法檢測(cè)標(biāo)志性蛋白TNF-α和TNFR1在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平;根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，采用siRNA干擾技術(shù)沉默TNFR1基因，檢測(cè)麻保沙星和氧氟沙星處理軟骨細(xì)胞8h軟骨細(xì)胞凋亡率和TNFR1下游分子基因表達(dá)水平的變化。
　　在24h內(nèi)，兩種藥物處理軟骨細(xì)胞凋亡率顯著性升高(p＜0.01)，細(xì)胞活性顯著下降(p＜0.01)

4、，且呈時(shí)間依賴關(guān)系;TNFR信號(hào)通路相關(guān)因子TNF-α、TNFR1、TRADD、FADD和Caspase-8的mRNA水平多數(shù)于8h達(dá)到高峰;死亡受體標(biāo)志性蛋白TNF-α以及TNFR1表達(dá)水平在2～24h顯著增加(p＜0.01);TNFR1基因沉默能夠顯著抑制(p＜0.01)麻保沙星或氧氟沙星誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡率，降低下游相關(guān)信號(hào)因子表達(dá)量。
　　本實(shí)驗(yàn)研究了QNs處理犬軟骨細(xì)胞24h內(nèi)死亡受體通路各相關(guān)因子的表達(dá)，并通過siRN