CEA細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)、克隆、表達(dá)及其融合蛋白在臨床血清學(xué)診斷中的研究.pdf

1、目的： 1.預(yù)測(cè)腫瘤相關(guān)抗原CEA的CTL、B細(xì)胞表位，可為肽段表位疫苗設(shè)計(jì)及其單克隆抗體的制備等研究提供理論依據(jù)。 2.經(jīng)過(guò)腫瘤相關(guān)抗原CEA的CTL、B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)分析，獲得了8個(gè)B細(xì)胞表位多肽和19個(gè)HLA-A*0201限制性候選抗原表位肽，選用分值較高的CTL、B細(xì)胞表位并結(jié)合“非選擇性”輔助T細(xì)胞表位，構(gòu)建含CTL、Th和B細(xì)胞多表位的原核重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-86/87，用帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽(His

2、.tag)的PET32a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)表位融合蛋白，并通過(guò)Ni-NTA樹(shù)脂親和層析法純化獲得表位融合蛋白，即ozlf-86/87。 3.將純化的表位融合蛋白o(hù)zlf-86/87作為抗原，采用間接ELISA方法檢測(cè)CEA陽(yáng)性大腸癌和胃癌腫瘤患者血清及健康對(duì)照者血清，初步分析表位融合蛋白的抗原性，為胃腸道惡性腫瘤相關(guān)疾病的疫苗設(shè)計(jì)及研制相關(guān)診斷試劑奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、以腫瘤相關(guān)抗原CEA的完整氨基酸序列為

3、基礎(chǔ)，采用SOPMA、GOR、nnPredict和HNN4種方法分別預(yù)測(cè)CEA的二級(jí)結(jié)構(gòu)：并結(jié)合其跨膜區(qū)域、親水性、表面可及性、抗原性、極性和柔韌性等綜合分析預(yù)測(cè)CEA可能的B細(xì)胞表位。用SYFPEITHI超基序法遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)系統(tǒng)的預(yù)測(cè)方法對(duì)CEA的HLA-A*0201限制性CTL表位預(yù)測(cè)，選取預(yù)測(cè)分值均高于(Score＞20)的HLA-A*0201限制性CTL表位。 2、根據(jù)預(yù)測(cè)分析得到的表位氨基酸序列，選取預(yù)測(cè)分值較高的CTL表

4、位(IMIGVLVGV)和B細(xì)胞表位(SNNSKPVEDK)，并結(jié)合“非選擇性”輔助T細(xì)胞表位(AKFVAAWTLKAAA)串聯(lián)起來(lái)，按原核系統(tǒng)偏愛(ài)的氨基酸密碼子優(yōu)化，委托生物技術(shù)公司合成寡核苷酸，退火獲得目的基因，并將目的基因克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)多克隆位點(diǎn)內(nèi)。將此重組載體轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)表達(dá)融合蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE、WesternBlot分析鑒定。用Ni-NTA樹(shù)脂親和層析法分別純化表位融合蛋白

5、ozlf-86/87。 3、用純化的ozlf-86/87蛋白作為診斷抗原，與此同時(shí)，以His蛋白和PBS作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。采用間接ELISA法分別對(duì)39例胃癌患者、25例結(jié)腸癌患者、30例健康對(duì)照者、30例慢性胃炎患者血清標(biāo)本的CEA抗體效價(jià)檢測(cè)，并分析其抗原性。根據(jù)健康對(duì)照組血清抗體的平均A值計(jì)算出陽(yáng)性判定值(Cutoff值)(健康對(duì)照組血清抗體平均A值+2S)，以此評(píng)估胃癌患者和結(jié)腸癌患者血清抗體陽(yáng)性檢出率及ELISA

6、方法診斷胃腸道惡性腫瘤的敏感度。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組間血清抗體陽(yáng)性率的比較采用x2檢驗(yàn)法，顯著性檢驗(yàn)水平均為0.05。 結(jié)果： 1、采用SYFPEITHI法對(duì)CEA的HLA-A*0201限制性的CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得了19條候選抗原表位多肽。通過(guò)多參數(shù)預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)的第150～160、168～172、207～211、332～338、372～377、467～472、485～49

7、0、507～516和580～584區(qū)段是CEA最有可能的B細(xì)胞表位。 2、嵌合有多表位目的基因的原核重組質(zhì)粒pET32a(+)/ozlf-86/87，進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，構(gòu)建成功。SDS-PAGE分析表明，重組質(zhì)粒在37℃1.0mMIPTG條件下誘導(dǎo)6h能很好地表達(dá)目的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為20kDa，與預(yù)期Mr大小吻合；蛋白表達(dá)量均約占細(xì)菌總蛋白量的20％。并經(jīng)Westernblot鑒定為目的蛋白。用Ni-NTA樹(shù)脂親

8、和層析法純化成功獲得表位融合蛋白，即ozlf-86/87，純度達(dá)到90％以上。 3、以ozlf-86/87融合蛋白診斷抗原檢測(cè)胃癌患者、結(jié)腸癌患者、慢性胃炎患者及健康對(duì)照者血清標(biāo)本中CEA特異性抗體，均值分別為0.4037±0.295，0.5082±0.460，0.1108±0.068，0.0677±0.046，用方差檢驗(yàn)分析，胃癌和結(jié)腸癌實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血清抗體效價(jià)之間均有顯著性差異(P＜0.01)。胃癌組和結(jié)腸癌組血清抗體效價(jià)

9、沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，慢性胃炎組和健康對(duì)照組血清抗體效價(jià)沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。根據(jù)健康對(duì)照組血清抗體的平均A值計(jì)算出陽(yáng)性判定值(Cutoff值)(健康對(duì)照組血清抗體平均A值+2S)為0.452，判斷胃癌組、結(jié)腸癌組、慢性胃炎組和健康對(duì)照組抗體陽(yáng)性率分別為35.9％(14/39)、44.0％(11/25)、0％(0)和0％(0)，胃癌組和結(jié)腸癌實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組陽(yáng)性率差異均有顯著性(P＜0.001)，慢性胃炎組與健

10、康對(duì)照組陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.預(yù)測(cè)并篩選了8個(gè)可能的CEA的B細(xì)胞表位和19個(gè)HLA-A2限制性候選表位肽，為腫瘤疫苗的設(shè)計(jì)提供了理論基礎(chǔ)。 2.通過(guò)分子克隆成功構(gòu)建了整合有CTL、Th和B細(xì)胞多表位的原核重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-86/87，并在原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)成功表達(dá)融合蛋白。 3.以ozlf-86/87融合蛋白作為診斷抗原，用ELISA法可以成功檢測(cè)胃癌患者和