毛乳頭體內(nèi)再生誘導(dǎo)模型的建立.pdf

1、目的：
　　1、建立單個(gè)大鼠觸須毛囊上段裸鼠皮下移植方法，利用大鼠觸須毛囊培養(yǎng)液作為促進(jìn)毛乳頭（dermal papilla，DP）再生的誘導(dǎo)來(lái)源，建立DP體內(nèi)再生誘導(dǎo)模型；
　　2、追蹤DP再生的完整過(guò)程，觀察毛囊培養(yǎng)液對(duì)DP再生率的影響；
　　3、追蹤模型中新生DP的細(xì)胞來(lái)源；
　　4、選取與毛囊真皮成分發(fā)生密切相關(guān)的Wnt5a信號(hào)分子：①追蹤wnt5a在DP再生過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)；②觀察wnt5a在大鼠DP胚

2、胎發(fā)生前后的表達(dá)模式；②對(duì)比DP體內(nèi)誘導(dǎo)模型與大鼠DP胚胎發(fā)生過(guò)程Wnt5a的表達(dá)模式，初步探討DP再生機(jī)制。
　　方法：
　　1、DP體內(nèi)再生誘導(dǎo)模型制作
　?、俅笫笥|須毛囊上段移植體的制作和鑒定：用顯微器械肉眼分離得到SD大鼠觸須毛囊，以鑷子輕輕夾住毛囊上端并擠壓，暴露毛囊下端紅色的含毛乳頭的毛球部，鏡下緊貼毛球部上方用新剃須刀片將其橫向裁切，得到大鼠觸須毛囊上段標(biāo)本。隨機(jī)抽取大鼠觸須毛囊上段標(biāo)本和切除的毛球部，掃

3、描電鏡觀察是否完整切除毛球部。
　?、诿遗囵B(yǎng)液的應(yīng)用：取大鼠觸須毛囊上段標(biāo)本時(shí)，挑選出移植用的生長(zhǎng)期毛囊，其余毛囊（100-140個(gè)），加入含10％血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液。第2、4、6、8天換液時(shí)留取舊液用滅酶的小管保存，1h內(nèi)裸鼠注射，注射于裸鼠毛囊移植點(diǎn)皮下，0.1ml/移植點(diǎn)。
　?、蹎蝹€(gè)大鼠觸須毛囊上段裸鼠皮下移植：
　　實(shí)驗(yàn)組：毛囊上段移植體用毛囊移植筆以30-45度角注射于裸鼠皮下，每個(gè)毛囊距離

4、1-1.5cm，背部左右兩側(cè)各三個(gè)。移植后第2，4，6，8天分別注射毛囊培養(yǎng)液；
　　對(duì)照組：移植方法同實(shí)驗(yàn)組，但移植后第2，4，6，8天分別注射含10%血清的DMEM培養(yǎng)液。移植后定期拍照、取材、制作石蠟切片，觀察形態(tài)學(xué)變化。
　　2、新生DPC來(lái)源追蹤
　　①分組：毛囊上段BrdU浸泡標(biāo)記組：大鼠觸須毛囊用含5μmol/L BrdU的10%血清DMEM培養(yǎng)基浸泡4小時(shí)后再切除毛球部，裸鼠皮下移植；
　　大鼠B

5、rdU標(biāo)記組：每隔2小時(shí)對(duì)大鼠腹腔注射5mg/kg的BrdU，連續(xù)注射4次后處死大鼠，取觸須毛囊，切除毛球部后進(jìn)行裸鼠皮下移植；
　　BrdU裸鼠注射標(biāo)記組：正常大鼠毛囊切除毛乳頭后進(jìn)行裸鼠皮下移植，取材前2h裸鼠腹腔注射5mg/kg的BrdU，2h后處死取材。
　　②定期取材，制作石蠟標(biāo)本并切片，熒光免疫組化追蹤BrdU的表達(dá)情況。
　　3、Wnt5a在大鼠毛囊胚胎發(fā)生和大鼠觸須毛囊上段裸鼠移植誘導(dǎo)DP再生模型中表達(dá)

6、的對(duì)比
　?、贌晒饷庖呓M化法觀察wnt5a在大鼠觸須毛囊上段裸鼠移植誘導(dǎo)DP再生過(guò)程的時(shí)空表達(dá)情況。
　?、诖笫驞P胚胎發(fā)生過(guò)程Wnt5a的表達(dá)模式：分別取E12.5、E13.5、E14.5、E15.5胎齡的大鼠胚胎，固定、制作蠟塊、切片，HE染色觀察表皮和真皮形態(tài)變化，免疫組化觀察wnt5a表達(dá)情況及時(shí)間變化趨勢(shì)。
　?、蹖?duì)比 DP體內(nèi)誘導(dǎo)模型與大鼠 DP胚胎發(fā)生過(guò)程 Wnt5a的表達(dá)模式，初步探討DP再生機(jī)制。

7、r>　　結(jié)果：
　　1、DP再生模型制作
　?、俅笫笥|須毛囊上段切除效果鑒定：電鏡掃描結(jié)果顯示，毛囊切面光滑，切除方法效果良好，外層有結(jié)締組織鞘包裹整個(gè)毛囊結(jié)構(gòu)，內(nèi)部可見(jiàn)外根鞘包裹毛根，未見(jiàn)毛乳頭。由于毛乳頭部位無(wú)毛根，因此可以確定毛乳頭已被完全切除。
　?、?DP再生誘導(dǎo)模型形成過(guò)程觀察：移植術(shù)后的裸鼠背部可見(jiàn)移植點(diǎn)距離均一，傷口微小，流血少，傷口恢復(fù)迅速。至第3天移植部位周?chē)つw長(zhǎng)出細(xì)密毛發(fā)。第22天在其中一個(gè)移植

8、點(diǎn)觀察到一根觸須樣的毛發(fā)纖維。大鼠處死后觀察：移植的毛囊上段沒(méi)有移位。移植的毛囊上段已向下生長(zhǎng)形成完整的毛球部，毛球部形態(tài)與觸須毛囊相似。毛囊周?chē)┴S富，毛囊上段可見(jiàn)一條類(lèi)似毛球部血供的紅色線狀結(jié)構(gòu)，輕輕擠壓此結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)毛囊下端突出于紅色的含新生毛乳頭的毛球部。
　　HE染色觀察：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠在毛囊斷端都有新生的結(jié)締組織包裹形成鞘狀，但對(duì)照組大鼠毛囊形成的結(jié)締組織鞘形狀不規(guī)則，在毛囊斷端形成明顯凹陷，新生成的結(jié)締組織鞘內(nèi)有

9、血供形成，但細(xì)胞數(shù)稀少，沒(méi)有形成毛乳頭。實(shí)驗(yàn)組大鼠觸須毛囊上段移植后第3天,毛囊斷端已被結(jié)締組織包裹,結(jié)締組織鞘已經(jīng)完整，中部斷端處稍向內(nèi)凹陷，但切斷痕跡并不明顯，內(nèi)部有細(xì)胞填充，但數(shù)量較少。移植后第7天,結(jié)締組織鞘增厚，毛乳頭外周開(kāi)始形成，內(nèi)有血管，毛乳頭外周也有大量細(xì)胞聚集，血供豐富。移植后第9天,結(jié)締組織鞘明顯增厚，內(nèi)部細(xì)胞生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，典型的梨形毛乳頭已經(jīng)形成，毛囊斷端移植部位周?chē)行∶艺谛纬?。移植后?周,大鼠毛囊整體

10、被結(jié)締組織鞘包裹，一側(cè)可以看到明顯斷端，此處結(jié)締組織鞘向外膨出，另一側(cè)則不明顯。典型、成熟DP已形成，移植體周?chē)霈F(xiàn)大量脂肪組織，與對(duì)照組相比，這些脂肪組織更像是新生成而不是裸鼠本身固有組織。所取實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本除少數(shù)毛囊移植體失活外，其余成活毛囊全部重新長(zhǎng)成不同生長(zhǎng)程度的毛乳頭，DP再生率為88%。
　　2、新生DPC來(lái)源觀察
　　實(shí)驗(yàn)組采取了三種不同的BrdU導(dǎo)入方式，通過(guò)熒光免疫組化證實(shí)，毛囊上段BrdU浸泡標(biāo)記組的導(dǎo)入效果

11、良好。
　　DP形成部位和毛囊斷端位置結(jié)締組織鞘的細(xì)胞BrdU呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，毛囊上段頂端細(xì)胞呈彌散性陽(yáng)性表達(dá)，提示再生的DP很可能來(lái)源于毛囊移植體的結(jié)締組織鞘。裸鼠皮膚無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。
　　3、Wnt5a在大鼠毛囊胚胎發(fā)生和大鼠觸須毛囊上段裸鼠移植誘導(dǎo) DP再生模型中的表達(dá)模式：
　　①實(shí)驗(yàn)組大鼠觸須毛囊上段移植后第3天，在毛囊上段頂端和毛囊斷端的結(jié)締組織鞘Wnt5a呈高表達(dá)。移植后第7天，頂端細(xì)胞逐漸向下分化形成DP

12、細(xì)胞，呈強(qiáng)陽(yáng)性，毛球部外周 Wnt5a呈陽(yáng)性表達(dá)，毛囊斷端的結(jié)締組織鞘 Wnt5a呈高表達(dá)。移植后第9天，典型的梨形DP已形成，其中Wnt5a呈強(qiáng)陽(yáng)性。
　?、?E12.5 Wnt5a在表皮細(xì)胞表達(dá)；E13.5 Wnt5a在表皮細(xì)胞表達(dá)，且表達(dá)增強(qiáng)；E14.5 Wnt5a表達(dá)由表皮轉(zhuǎn)移至真皮，在真皮細(xì)胞漿明顯表達(dá)；E15.5 Wnt5a表達(dá)在真皮結(jié)締組織明顯增強(qiáng)，在表皮的表達(dá)消失。
　　結(jié)論：
　?、俦狙芯拷⒌膯蝹€(gè)大

13、鼠觸須毛囊上段裸鼠移植誘導(dǎo)DP再生的模型，DP體內(nèi)再生率最高、穩(wěn)定、可重復(fù)性高，可以作為研究DP體內(nèi)再生的良好平臺(tái)；
　?、诿乙浦补P的應(yīng)用使毛囊上段移植部位創(chuàng)傷小，愈合迅速；其次移植的毛囊方向、角度、深度具有高度可控性；并可實(shí)現(xiàn)單個(gè)毛囊的移植；
　?、勖遗囵B(yǎng)液短期、小量應(yīng)用即可高效促進(jìn)毛球部DP的再生；
　　④再生的DPC可能來(lái)自毛囊移植體的結(jié)締組織鞘；
　?、?Wnt5a在DP胚胎發(fā)生前后及本模型DP形成的