SD大鼠牙乳頭與微孔濾膜結合誘導牙本質樣結構再生的研究.pdf

1、牙乳頭（dental papillae）由未分化間充質細胞組成，是牙胚發(fā)育過程中的一過性組織，密集分布于成釉器下方，是成牙本質細胞細胞的來源組織，對牙本質形成發(fā)揮主要作用。原發(fā)性牙本質（primary dentine）是牙齒發(fā)育完成之前形成的牙本質，它的形成受到上皮與牙源性間充質相互作用的控制，這種調節(jié)是通過基底膜（basement membrane,BM）介導的?；啄な怯梢粚犹厥獾谋∑瑺罴毎饣|（extracellular mat

2、rix,ECM）構成，位于上皮與牙源性間充質之間，作為一個動態(tài)結構參與了多種細胞分化和功能構建。
　　基底膜是誘導成牙本質細胞分化與促進牙本質形成的天然支架。它是牙源性上皮組織的誘導下由間充質和上皮共同形成的纖維網狀結構，但在成體情況下,上皮來源的組織隨著牙齒的發(fā)育成熟逐漸萎縮消失。因此，找到一種能夠仿照上皮發(fā)揮誘導作用的途徑對于基底膜的形成和牙本質的再生就顯得十分關鍵。有學者研究發(fā)現，結合有牙本質基質蛋白(DMP)或TGF-β的

3、微孔濾膜在狗的穿髓模型中能夠誘導成牙本質細胞分化和形成牙本質，促進修復性牙本質對病損部位的防御。我們想到能否用類似的方法用于組織工程化牙本質的研究呢？可以設想在牙本質再生過程中找到一種膜性材料能夠部分發(fā)揮基底膜的功能，從而誘導形態(tài)規(guī)則的管狀牙本質的形成，以達到預期的生成效果。為此我們設計了以下實驗：
　　1.牙乳頭組織與復合有TGF-β1微孔濾膜結合后誘導成牙本質細胞樣細胞分化的體外實驗
　　取出生后4d仔鼠，處死后浸入75

4、％乙醇中15s。無菌條件下分離上下頜，體視顯微鏡下在PBS液中將頜骨骨板挑開，分離第一和第二磨牙牙胚，將磨牙胚外軟組織去凈后，機械分離成釉器和牙乳頭，將分離的牙乳頭組與復合有TGF-β的微孔濾膜相結合，放置于Millicell插入式培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。一周后取出培養(yǎng)物，4％多聚甲醛固定24小時，用于掃描電鏡觀察、HE和免疫組織化學染色。結果表明牙乳頭組織細胞在濾膜表面貼附生長，細胞突起伸入濾膜孔徑中，與濾膜牢固結合；HE染色顯示牙乳頭組織與微

5、孔濾膜結合緊密，沿著微孔濾膜觀察到呈層狀排列的細胞，細胞高度大體一致，部分細胞呈極化狀態(tài)，垂直于濾膜表面。免疫熒光染色DSP及DMP-1可見貼附濾膜表面的細胞呈陽性。
　　2.牙乳頭組織與復合有TGF-β1微孔濾膜結合后誘導牙本質樣結構再生體內實驗
　　取出生后4d的仔鼠，處死后浸入75％乙醇中15s。無菌條件下分離上下頜，體視顯微鏡下在PBS液中將頜骨骨板挑開，分離第一和第二磨牙牙胚，將磨牙胚外軟組織去凈后，機械分離成釉器

6、和牙乳頭。體視顯微鏡下剪開牙乳頭，將準備好的微孔濾膜置入，在DMEM中37℃培養(yǎng)箱中孵育24小時，制備好的重組體用于移植。將體重約300gSD大鼠暴露腎臟，將重組體植入腎被膜下。14天后取移植物檢測。結果可見層狀礦化物在微孔濾膜表面上方形成，厚度均勻一致，礦化物結構致密。移植物HE染色可見大量礦化基質沿微孔濾膜沉積，礦化物厚度較一致，在基質表面有極化的成牙本質細胞樣細胞分布。DSP與DMP-1免疫熒光染色，提示在靠近礦化基質的成牙本質樣

7、細胞表達陽性，呈帶狀分布。
　　3.牙乳頭細胞團與復合有TGF-β1微孔濾膜結合后誘導成牙本質細胞樣細胞分化的體外實驗
　　取出生后4d仔鼠，分離出牙乳頭組織，將其剪成1mm3大小組織塊，消化培養(yǎng)原代牙乳頭細胞。鋪滿后傳代。待第二代細胞鋪至80～90％，消化離心成團，移至準備好的微孔濾膜上，一起放入含血清的DMEM中，37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)7d。取出培養(yǎng)物，4％多聚甲醛固定48h，用于掃描電鏡觀察、HE及免疫組化染色。

8、結果顯示細胞團在微孔濾膜上生長良好，一部分細胞突起深入濾膜的孔徑中，HE染色顯示細胞團與微孔濾膜界限清晰，靠近微孔濾膜的細胞極化，垂直于濾膜排列，形態(tài)發(fā)生高柱狀變化。免疫熒光染色可見DSP和DMP-1在沿微孔濾膜分布的高柱狀分化細胞呈弱陽性表達.
　　4.牙乳頭細胞團與復合有TGF-β1微孔濾膜結合后誘導牙本質樣結構再生體內實驗
　　取出生后4d的仔鼠，分離出牙乳頭組織后，將牙乳頭組織剪成1mm3大小組織塊，消化培養(yǎng)原代牙乳

9、頭細胞。鋪滿后傳代。待第二代細胞鋪至80～90％，消化離心成團，移至準備好的微孔濾膜上，置于DMEM中37℃培養(yǎng)箱中孵育24小時，制備好的重組體被用于移植。將體重約300gSD大鼠暴露腎臟，將重組體植入腎被膜下。飼養(yǎng)14天后大鼠脫頸處死，取移植物用于檢測。結果顯示：大量礦化基質沿微孔濾膜沉積，基質厚度較一致，礦化部分呈現管狀牙本質樣結構。在基質表面有排列整齊的成牙本質細胞樣細胞分布。DSP和DMP-1免疫熒光染色中靠近基質的高柱狀細胞表