失巢凋亡與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:
　?。?）建立人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的體外失巢模型，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究失巢培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞的蛋白表達(dá)變化，了解失巢凋亡在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制。
　　（2）探討“嵌入式死亡”在MCF-7細(xì)胞失巢過程中的作用及其相關(guān)分子信號。
　　方法:
　?。?）采用陰離子聚合物Poly-HEMA(多聚2-羥乙基甲基丙烯酸脂)包被的六孔板對MCF-7細(xì)胞進(jìn)行多輪懸浮培養(yǎng)，利用流式細(xì)胞儀以及激光

2、共聚焦顯微鏡，采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法觀察非失巢組和失巢組的細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞形態(tài)變化，確定失巢培養(yǎng)“馴化”終點(diǎn)，獲得具有高抗失巢凋亡特性的MCF-7細(xì)胞作為后期實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。收獲失巢終點(diǎn)的MCF-7細(xì)胞及正常貼壁MCF-7細(xì)胞，并提取總蛋白，進(jìn)行雙向凝膠電泳（2-DE）與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)檢測，鑒定表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)并選取部分進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證，并以高轉(zhuǎn)移特性的腫瘤細(xì)胞

3、作為陽性對照。
　　（2）失巢馴化MCF-7細(xì)胞，收集每輪次培養(yǎng)6h的細(xì)胞并采用CellTracker細(xì)胞示蹤染料進(jìn)行標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)化率。選擇細(xì)胞內(nèi)化率最高的第一輪失巢培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞分為非內(nèi)化組（失巢培養(yǎng)0h）和內(nèi)化組（失巢培養(yǎng)6h），收獲細(xì)胞并提取總蛋白進(jìn)行2-DE分離與MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜檢測，鑒定表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)并選取部分進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　（1）經(jīng)過失巢馴

4、化后MCF-7細(xì)胞抱團(tuán)生長,第一輪至第四輪失巢培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞凋亡率分別為40.62±5.35％，23.94±7.78%，17.78±3.92%，15.70±3.82%。前三輪細(xì)胞凋亡率逐漸降低。第四輪與第三輪的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，確定第三輪為失巢馴化終點(diǎn)。差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出8個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，在細(xì)胞中分別參與蛋白折疊、細(xì)胞周期與增殖、糖酵解等過程，選取ω-酰胺酶NIT2（Omega-amidase NIT2），埃茲

5、蛋白（Ezrin），人類表皮生長因子受體2(HER-2)進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證，與質(zhì)譜結(jié)果吻合。
　?。?）細(xì)胞示蹤染色法檢測MCF-7細(xì)胞經(jīng)過第一至第三輪失巢培養(yǎng)6h后細(xì)胞內(nèi)化率分別為32.50±9.60%、24.40±8.60%和14.70±6.90%，內(nèi)化率隨著失巢輪數(shù)的增加而逐漸下降。分別提取內(nèi)化組與非內(nèi)化組率細(xì)胞總蛋白進(jìn)行2-DE分離和MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜鑒定，鑒定出18個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，在細(xì)胞中分別參與蛋白

6、酶解、細(xì)胞周期與增殖、氧化還原等過程。選取組織蛋白酶-D(CTSD)，局部粘著斑激酶(FAK)，上皮細(xì)胞粘連蛋白（E-cadherin），Rho樣小GTP酶（Rac1）進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證，與質(zhì)譜結(jié)果吻合。
　　結(jié)論:
　?。?）成功建立人乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外失巢模型，經(jīng)過馴化后的腫瘤細(xì)胞抗失巢凋亡能力提高，NIT2，Ezrin，HER-2在失巢培養(yǎng)與正常貼壁培養(yǎng)過程中的表達(dá)有差異，可作為進(jìn)一步探討乳腺癌惡化或轉(zhuǎn)移的靶向蛋白