乳腺癌轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其關(guān)鍵因子的功能研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年提高,已成為嚴(yán)重威脅女性健康的重大疾病之一。乳腺癌轉(zhuǎn)移是致死的首要原因,轉(zhuǎn)移一旦發(fā)生就預(yù)后不佳,極難治愈。高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為乳腺癌轉(zhuǎn)移研究提供了良好的技術(shù)支持,使人們能夠系統(tǒng)地研究轉(zhuǎn)移過(guò)程中蛋白質(zhì)的組成及變化規(guī)律,進(jìn)而篩選能夠用于靶向藥物設(shè)計(jì)的候選蛋白質(zhì)。在本論文研究中,我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),緊緊圍繞乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)問(wèn)題,開(kāi)展了一系列尋找轉(zhuǎn)移關(guān)鍵因子的研究。本研究在實(shí)驗(yàn)室已

2、有的微升級(jí)質(zhì)譜分析平臺(tái)基礎(chǔ)上,升級(jí)硬件系統(tǒng),完善軟件系統(tǒng),搭建適用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品鑒定的納升級(jí)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)。標(biāo)準(zhǔn)樣品檢驗(yàn)表明,該平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品的納升水平穩(wěn)定分離,并且蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度達(dá)到飛摩爾水平。該平臺(tái)的建立,為我們實(shí)驗(yàn)室有效開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ),也成為本論文開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴應(yīng)用2D-LC-MS/MS的技術(shù)線路進(jìn)行乳腺癌血清樣品

3、的蛋白組學(xué)研究,篩選乳腺癌早期轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。通過(guò)對(duì)三組血清樣品(健康對(duì)照組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移DCIS、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移DCIS)的樣品處理、質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)分析,篩選得到了一系列在不同血清樣品組間存在顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過(guò)大規(guī)模血清樣品的ELISA驗(yàn)證表明, TNXB在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病人血清中含量顯著降低,是有潛力的乳腺癌早期轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物。
　　⑵應(yīng)用GeLC-MS/MS的技術(shù)線路通過(guò)比較不同轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞的分泌組學(xué),篩選介導(dǎo)乳腺

4、癌骨定向轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子,并對(duì)某些因子進(jìn)行了功能驗(yàn)證。我們選用在人源乳腺癌細(xì)胞株MDA231基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)單細(xì)胞篩選得到的具有不同骨轉(zhuǎn)移能力的單細(xì)胞克隆株SCP2、SCP4、SCP6和SCP46,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定每種細(xì)胞的分泌蛋白。經(jīng)過(guò)基于非標(biāo)記定量分析,我們篩選得到了128個(gè)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分泌蛋白,其中有118個(gè)蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中沒(méi)有被鑒定到。通過(guò)生物學(xué)功能分析,我們發(fā)現(xiàn)在這些差異表達(dá)分泌蛋白中,酶活性調(diào)節(jié)功能被顯著富集

5、,其中包括多個(gè)cystatin家族成員。我們進(jìn)一步驗(yàn)證其中的CST6在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的功能。利用CST6過(guò)表達(dá)或沉默細(xì)胞株,在動(dòng)物水平研究表明,CST6過(guò)表達(dá)/沉默能顯著抑制/促進(jìn)乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移,減弱/增強(qiáng)溶骨性損毀,提高/降低小鼠的生存率。我們的工作揭示CST6是一個(gè)在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用的重要蛋白質(zhì)。
　?、峭ㄟ^(guò)比較4T1系列細(xì)胞株的分泌組學(xué)篩選腫瘤誘導(dǎo)機(jī)體免疫抑制的關(guān)鍵因子,并進(jìn)行功能驗(yàn)證。腫瘤介導(dǎo)的機(jī)體免疫抑制在腫瘤

6、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。髓源抑制性細(xì)胞(MDSCs)是繼Tregs, TAMs, TADCs后發(fā)現(xiàn)的另一類(lèi)腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制細(xì)胞。我們選用來(lái)源于同一小鼠自發(fā)乳腺癌的具有相同遺傳背景、不同轉(zhuǎn)移能力的4 T1系列細(xì)胞株(67NR,168FARN,4TO7,4 T1)開(kāi)展研究。四種細(xì)胞株的荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)表明,細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移能力與其體內(nèi)誘導(dǎo)MDSCs的能力成正比,而且誘導(dǎo)因子來(lái)源于具有轉(zhuǎn)移能力腫瘤細(xì)胞的分泌蛋白。通過(guò)對(duì)四種細(xì)胞株的分泌組學(xué)研究,我們

7、得到了26個(gè)與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白質(zhì),其中包括多種細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)及酶活性調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)。我們挑選其中的G-CSF、U P A和LIF,進(jìn)一步驗(yàn)證這幾個(gè)因子在小鼠中誘導(dǎo)MDSCs的能力。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株中高表達(dá)的G-CSF能夠在體內(nèi)強(qiáng)烈誘導(dǎo)MDSCs的增殖、動(dòng)員和募集,并且其誘導(dǎo)的MDSCs具有免疫抑制活性。我們的工作表明G-CSF是誘導(dǎo) MDSCs介導(dǎo)機(jī)體免疫抑制、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。
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8、用于微量復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品鑒定的納升級(jí)蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái),并將其應(yīng)用于乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)問(wèn)題研究。我們基于血清蛋白質(zhì)組學(xué),篩選得到可用于乳腺癌早期轉(zhuǎn)移預(yù)后的生物標(biāo)志物。通過(guò)鑒定比較不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞株的分泌蛋白質(zhì)組,并結(jié)合免疫調(diào)節(jié)或器官定向轉(zhuǎn)移的特征,我們獲得了一系列與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵因子,并對(duì)其中的某些關(guān)鍵因子進(jìn)行深入的功能研究。此外,本論文的研究將促進(jìn)我們對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和了解,為針對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的靶向藥物設(shè)計(jì)提供了更多的