MAGE-3多肽納米疫苗的制備及其對(duì)小鼠胃癌種植瘤的抑瘤效應(yīng).pdf

1、研究背景：腫瘤的發(fā)病率較高，部分患者經(jīng)綜合治療后仍不免復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳。如何消滅微小轉(zhuǎn)移灶，抑制殘余腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)等是亟需解決的問(wèn)題。常規(guī)治療手段都存在各自的缺陷，生物治療作為第四種治療模式，因其具有特異性強(qiáng)，毒副作用低，對(duì)機(jī)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛的重視。 腫瘤疫苗是極具前景的研究方向之一，其應(yīng)用成功將對(duì)腫瘤的預(yù)防及治療產(chǎn)生巨大的意義，而多肽疫苗是目前研究最多的腫瘤治療性疫苗之一。與腫瘤細(xì)胞疫苗、基因工程疫苗等傳統(tǒng)疫苗相

2、比，多肽疫苗具有特異性高、安全、設(shè)計(jì)方便、能大量合成高純度的高度可重復(fù)性肽等優(yōu)點(diǎn)，因而已成為腫瘤治療性疫苗研究的熱點(diǎn)，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的腫瘤免疫治療方法。但其分子量小，易在體內(nèi)降解，免疫原性低，需要一種合適的載體材料克服此弊病。納米顆粒是一類(lèi)極具開(kāi)發(fā)潛力的新型疫苗載體，運(yùn)用納米顆粒作為載體克服了傳統(tǒng)疫苗的許多缺陷和無(wú)法解決的問(wèn)題，其對(duì)抗原起保護(hù)作用，可防止其在體內(nèi)新陳代謝過(guò)程中過(guò)早降解，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的滯留時(shí)間，有利于提高免疫效應(yīng)

3、。且因納米粒子非常小，一旦注射后可經(jīng)皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)，沿直線到達(dá)區(qū)域淋巴結(jié)，此處可激活的樹(shù)突狀細(xì)胞濃度將數(shù)千倍于其在皮膚中的濃度，由此誘發(fā)的免疫效應(yīng)強(qiáng)烈且有效，具有一定的“淋巴靶向性”。但是傳統(tǒng)的納米材料生物相容性差，在體內(nèi)不易降解，各種具有特殊性能的納米顆粒在制備工藝上需要高溫、有機(jī)溶劑、乳化劑或表面活性劑，易造成蛋白/多肽分子活性破壞，極大地限制了其在醫(yī)藥疫苗載體中的應(yīng)用。 目的：設(shè)計(jì)合適的表位多肽抗原；獲得良好的負(fù)載多肽納

4、米載體；探討納米介導(dǎo)的MAGE—3多肽納米疫苗對(duì)小鼠胃癌種植瘤的抑瘤效應(yīng)。 方法：采用化學(xué)偶聯(lián)法合成殼聚糖—脫氧膽酸兩親性共聚物，紅外光譜分析(FTIR)及核磁共振分析(1H NMR)對(duì)共聚物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。 采用芘熒光探針?lè)y(cè)定共聚物臨界聚集濃度(CAC)，透射電子顯微鏡(TEM)觀察殼聚糖—脫氧膽酸納米顆粒的微觀形態(tài)及粒徑，動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測(cè)定其流體力學(xué)直徑。 由計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)，參考MAGE—3多肽體

5、外鑒定實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)含有MHC—Ⅰ及MHC—Ⅱ類(lèi)分子限制性MAGE—3表位多肽抗原。 通過(guò)自組裝構(gòu)建制備負(fù)載多肽的納米顆粒，用Zeta電位法測(cè)定多肽負(fù)載前后電荷變化。 采用熒光分光光度法測(cè)定負(fù)載前后多肽的含量，計(jì)算負(fù)載率、載藥量并研究其釋放規(guī)律。 構(gòu)建胃癌種植瘤模型，皮下注射給藥，觀察腫瘤體積大小的變化，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線圖，并采用單因素方差分析及秩和檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。記錄小鼠的生存時(shí)間，采用Log—rank檢驗(yàn)統(tǒng)

6、計(jì)分析各組生存期有無(wú)差異，并繪制Kaplan—Meier生存曲線。所有統(tǒng)計(jì)過(guò)程均由SPSS13.0完成。 結(jié)果： 1)紅外光譜(FTIR)及核磁共振分析(1H NMR)證明脫氧膽酸與殼聚糖發(fā)生了偶聯(lián)，形成了Chit—DC共聚物。 2) Chit—DC在PBS6.2緩沖溶液中能夠形成膠束，CAC值為0.12 mg/mL。 3)透射電鏡觀察示Chit—DC顆粒呈約30-50 nm的粒子，動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定Chi

7、t—DC顆粒的流體力學(xué)半徑約200 nm。 4) Zeta電位測(cè)定法測(cè)定負(fù)載后納米顆粒的電位為13.8。 5)納米載體的負(fù)載率及載藥量分別為37.3％，17.0％。 6)載藥納米顆粒中的多肽抗原約在48h后釋放完全。 7)單因素方差分析顯示載疫苗納米顆粒與空白納米組、PBS組相比，腫瘤體積在觀察后期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其與多肽+IFA組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多肽納米組相對(duì)腫瘤增殖率(％)為37.81。 8