mVEGF表位疫苗在小鼠移植瘤的應(yīng)用.pdf

1、腫瘤的生長(zhǎng)離不開營(yíng)養(yǎng)的供給,因此,腫瘤新生血管的形成對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)具有重要意義。在眾多血管生成有關(guān)的細(xì)胞因子中,VEGF是最重要的調(diào)節(jié)因子,很多腫瘤的生長(zhǎng)過程都伴隨著VEGF的高表達(dá),許多研究表明,抑制VEGF的生物學(xué)活性就能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
　　目前,用VEGF抗體治療腫瘤取得了一定的臨床效果,但仍存在許多不足。臨床使用的VEGF抗體為人源化抗體,雖然人源化程度較高,但仍存在異源性的問題。由于臨床上用抗體治療腫瘤需要反復(fù)多次用藥

2、,因此,抗體本身的異源性問題不容忽視。另外,抗體臨床用量較大,其生產(chǎn)成本較高,導(dǎo)致抗體藥物的價(jià)格較高,也一定程度上限制了其使用范圍。
　　用外源VEGF抗體治療腫瘤是一種被動(dòng)免疫治療。如果能夠采用主動(dòng)免疫治療,則可以避免VEGF抗體治療的一些不足,如用藥次數(shù)多、存在異源性等問題。但是VEGF是機(jī)體自身產(chǎn)生的蛋白質(zhì),有其正常的生理功能,機(jī)體對(duì)正常的自身蛋白存在免疫耐受,用自身VEGF蛋白難以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)自身VEGF的抗體。

3、>　　本文的目的就是要設(shè)計(jì)一種mVEGF疫苗,繞開或打破機(jī)體的免疫耐受,讓機(jī)體能夠產(chǎn)生識(shí)別mVEGF的中和性抗體,以抑制腫瘤新生血管的生成,最終實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。
　　為了實(shí)現(xiàn)上述目的,我們確定了mVEGF疫苗設(shè)計(jì)的基本策略,即以mVEGF空間結(jié)構(gòu)為依據(jù),尋找mVEGF可能的抗原表位,將這些可能的抗原表位展示在一種簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)骨架之上,形成一種新蛋白,用這種新蛋白作為可能的mVEGF疫苗。
　　首先,我們選擇了抗體重鏈

4、可變區(qū)作為抗原表位展示的骨架蛋白,由于抗體的抗原結(jié)合部位是由抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)共同組成,單獨(dú)的重鏈抗體可變區(qū)存在穩(wěn)定性差的缺點(diǎn),經(jīng)過分析,我們將抗體重鏈可變區(qū)的部分氨基酸進(jìn)行了突變,突變后的重鏈可變區(qū)蛋白可以很容易地實(shí)現(xiàn)原核表達(dá),并可復(fù)性為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。由于抗體的重鏈可變區(qū)的CDR3區(qū)的是高度可變的,能夠容忍不同長(zhǎng)度序列的插入或置換,因此,CDR3區(qū)被我們選為抗原表位展示部位。
　　根據(jù)人VEGF165的空間結(jié)構(gòu),我們分析了小

5、鼠VEGF164的可能的抗原表位,其中表位1(EYPDEIEYIFKP)、表位2(KSHEVIKFMDV)和表位3(IMRIKPHQSQH)有可能是mVEGF的中和性抗原表位。
　　我們用表位2的氨基酸序列替換抗體重鏈可變區(qū)的CDR3區(qū)氨基酸序列,形成一種新的蛋白質(zhì),命名為mFV2。將此序列轉(zhuǎn)換為其基因編碼序列,全基因合成其編碼序列,并克隆到pET-24a表達(dá)載體上,構(gòu)建了表位2表達(dá)載體。將該載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌,通過

6、IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了mFV2的高表達(dá),表達(dá)的mFV2蛋白主要以包涵體形式存在,包涵體經(jīng)過洗滌、純化、裂解后,用SephacrylS-100凝膠過濾柱進(jìn)行了純化,獲得了高純度的mFV2蛋白,通過稀釋法成功復(fù)性了mFV2蛋白。
　　通過重疊PCR法將表位1和表位3編碼基因成功插入到抗體可變區(qū)載體蛋白的CDR3區(qū)中,同樣實(shí)現(xiàn)了mFV1和mFV3的表達(dá)、純化和復(fù)性。
　　在獲得了三種小鼠表位疫苗蛋白mFV1、mFV2和mFV3后,我們

7、首先驗(yàn)證了三種疫苗蛋白的免疫效果。用三種疫苗蛋白分別免疫雌性Balb/c小鼠,免疫5周后小鼠眼眶取血,獲得三種免疫血清,命名為pAb1、pAb2和pAb3。ELISA檢測(cè)表明,三種免疫血清的滴度均達(dá)到1:104,并且能夠特異性識(shí)別VEGF164,而不與無關(guān)蛋白反應(yīng),這表明,這三種疫苗蛋白的確能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性識(shí)別VEGF164的抗體。WesternBlot檢測(cè)顯示,免疫血清pAb1和pAb2能夠識(shí)別VEGF164,但pFV3則不能識(shí)

8、別VEGF164,很可能表位3是一種空間表位,在WesternBlot中該表位不能保持其空間結(jié)構(gòu)。另外,通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明,三種免疫血清都能識(shí)別B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)的VEGF164,B16細(xì)胞表達(dá)的VEGF164主要分布在胞漿中。
　　為了驗(yàn)證三種免疫血清是否具有VEGF164中和活性,我們分析了三種免疫血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖、遷移和成管能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,VEGF164能夠促進(jìn)HUVEC的增殖、

9、遷移及成管,而pAb1、pAb2、pAb3均表現(xiàn)出了一定的mVEGF抑制活性,其中pAb3表現(xiàn)出了理想的VEGF164抑制活性。
　　上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,三種免疫血清的確具有VEGF164中和活性,能夠抑制VEGF164的生物學(xué)功能。在此基礎(chǔ)上,我們開展了mVEGF疫苗治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究。
　　首先,我們采用預(yù)防接種的方式觀察三種mVEGF疫苗是否具有抑制H22實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用。實(shí)驗(yàn)選用6-8周的雌性BALB/c小鼠,分為

10、四組,分別是模型組、mFV1組、mFV2組和mFV3組。mFV1組、mFV2組和mFV3組分別用mFV1蛋白、mFV2蛋白和mFV3蛋白免疫三次,第5周通過ELISA檢測(cè)免疫效果,并開始接種H22腫瘤細(xì)胞,待腫瘤生長(zhǎng)到可用手摸到時(shí)開始記錄腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài),并最終處死小鼠,分離腫瘤,稱量腫瘤大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三種mVEGF疫苗均表現(xiàn)出了一定的抑制H22腫瘤生長(zhǎng)的能力,其中,mFV3疫苗的效果最理想,抑瘤率達(dá)到83.8％,mFV2次之,mFV

11、1最差。
　　為了更直觀地了解mVEGF疫苗的抑瘤機(jī)制,將H22腫瘤模型實(shí)驗(yàn)中各組的腫瘤組織進(jìn)行了免疫組化檢測(cè),結(jié)果顯示,疫苗治療組微血管密度比模型組低,其中mFV3免疫組腫瘤的微血管密度減少最為明顯,這就是為什么在三種疫苗蛋白中mFV3抑瘤作用最好的原因。
　　同樣地,利用S180腫瘤模型驗(yàn)證了三種mVEGF疫苗的抑瘤效果。在S180腫瘤模型上,三種疫苗的抑瘤表現(xiàn)與在H22腫瘤模型上的表現(xiàn)一致,也是mFV3疫苗的效果最理想

12、,抑瘤率為80.3%,mFV2次之,mFV1最差。
　　為了模擬臨床上疫苗使用的實(shí)際情況,我們又開展了治療性接種mVEGF疫苗對(duì)腫瘤生長(zhǎng)影響及與化療藥物共用的效果觀察。實(shí)驗(yàn)仍選用6-8周的雌性BALB/c小鼠,分為四組,分別是模型組、mFV3治療組、順鉑治療組和mFV3+順鉑組。實(shí)驗(yàn)中接種H22腫瘤細(xì)胞與給藥同時(shí)進(jìn)行,模型組僅注射生理鹽水,順鉑組注射順鉑2mg/kg,每周一次,連續(xù)用藥2次,mFV3+順鉑組為順鉑和mFV3聯(lián)合治療

13、,小鼠接種腫瘤細(xì)胞后,注射順鉑(2mg/kg)并同時(shí)進(jìn)行mFV3免疫,順鉑每周一次,連續(xù)用藥2次,第14天進(jìn)行mFV3第二次免疫,于第28天處死小鼠,并剝離腫瘤組織,測(cè)量腫瘤大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為,單純mFV3免疫組腫瘤抑制率為27.3%,單純順鉑治療組腫瘤抑制率為35.7%,而mFV3免疫+順鉑治療組的腫瘤抑制率達(dá)到了66.2%。可見,mVEGF疫苗治療和化療之間并不沖突,二者有較好的協(xié)同效應(yīng),可聯(lián)合用于腫瘤的治療。
　　綜上所述,本