WT1肽疫苗體外及小鼠體內(nèi)抗瘤效應(yīng)的研究.pdf

1、分類號密級Y903244單協(xié)代碼學(xué)號WTl肽疫苗體外及小鼠體內(nèi)抗瘤效應(yīng)的研究研冗生：樊里堊指導(dǎo)教師：至筮住熬援合作指導(dǎo)教師：申請學(xué)位門類級別：專業(yè)名稱：研究方向：匡堂煌內(nèi)抖查遙堂魚遺疸筮王生物所在學(xué)院：出酉醫(yī)型丕主笠三】照壓匡堂瞳2006年5月27日10114B2003025山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文和小鼠體內(nèi)激發(fā)特異CTL成功(同時具有人HLA—A0201和小鼠H一2D6I類分子錨定位點(diǎn))的WTl9肽：WT卜126和wT卜235，分別通

2、過體外誘導(dǎo)特異CTL、瘤細(xì)胞殺傷試驗以及小鼠體內(nèi)抗瘤試驗，進(jìn)一步明確WTl肽疫苗是否有抗瘤效應(yīng)，同時通過比較兩種WTl肽聯(lián)合應(yīng)用與任意一種的免疫效果，明確兩種WTl肽聯(lián)合應(yīng)用時相互之間的作用(協(xié)同、拮抗或不相關(guān))，也即明確聯(lián)合肽疫苗在個體內(nèi)提高亦或是降低肽疫苗療效，為探索疫苗效應(yīng)機(jī)制、提高肽疫苗效應(yīng)提供基礎(chǔ)資料，同時也為下一步WTl聯(lián)合肽疫苗提高群體有效率的研究奠定了基礎(chǔ)。第一部分wTl肽疫苗體外抗瘤效應(yīng)的研究l合成溶解和分裝肽合成純度

3、大于95％，同時含有人HLA—A0201和小鼠H一2D6I類分子錨定位點(diǎn)的兩種9肽，WTI一126肽(肽1)：RMFPNAPYL、WTl—235肽(肽2)：CMTⅣNQMNL。分別用PBS和DMSO溶解并分裝，80℃保存?zhèn)溆谩?鑒定健康供者及各細(xì)胞株HL^A位點(diǎn)基因型別按照試劑盒操作說明進(jìn)行位點(diǎn)特異PCR。在33名大學(xué)一年級健康供者中，鑒定出8名HLA—A0201陽性供者。對7種細(xì)胞株的鑒定得知SW480、HEK一293、T2為HLA—

4、h0201型別，HL_60為HLA—A0203型別，Hela、K562、BGC一823非h02型別。選定SW480、HEK一293、T2、K562用作實(shí)驗靶細(xì)胞。3RTPCR鑒定細(xì)胞WTl表達(dá)與否RT—PCR對已選定的靶細(xì)胞和正常人T細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示SW480和HEK～293細(xì)胞高表達(dá)WTl、T2細(xì)胞和正常人T細(xì)胞低或不表達(dá)WTl。4分離培養(yǎng)DC用自己摸索的方法分離200ml抗凝外周血中的PBMC，即離心取血漿與紅細(xì)胞的交界層細(xì)胞，適當(dāng)

5、稀釋后加至Ficool上分離。常規(guī)培養(yǎng)Dc。Dc培養(yǎng)前后，經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)檢測CDl4、CD80、CD86、CD83、DR等細(xì)胞表面標(biāo)志，說明誘導(dǎo)培養(yǎng)DC獲得成功。培養(yǎng)二。n任甲，偶爾發(fā)現(xiàn)不加任何細(xì)胞因子，僅用IO％FCS、3％滅活A(yù)B血清的培養(yǎng)液，也可誘導(dǎo)單核細(xì)胞長出明顯的突起，但培養(yǎng)孔中長時間貼壁的條梭狀的巨噬細(xì)胞明顯多于加細(xì)胞因子的培養(yǎng)孔。因此推測：滅活人血清中含有能誘導(dǎo)Dc發(fā)育的成份；用人血清培養(yǎng)DC可能需要補(bǔ)加少量IL4以抑制巨