胞膜主動外排系統(tǒng)介導(dǎo)鮑曼不動桿菌多重耐藥機制的研究及分子流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、鮑曼不動桿菌是醫(yī)院感染重要的條件致病菌，多重耐藥的鮑曼不動桿菌引起的感染在醫(yī)院中的大規(guī)模流行時有報導(dǎo)。2006-2008年本院臨床微生物監(jiān)測顯示的多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥譜十分相似。為了進一步明確2006-2008年我院出現(xiàn)的多重耐藥菌株的同源性及是否存在克隆傳播，本研究采用微生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用腸桿菌科基因問重復(fù)序列引物PCR(Enterobacterial repetitive intergenic consensusseq

2、uence-based PCR，ERIC-PCR)技術(shù)對從患者體內(nèi)分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌進行分子流行病學(xué)調(diào)查，并探討鮑曼不動桿菌的胞膜主動外排泵機制，分析其基因表型及耐藥性傳播機制，闡明其分子流行病學(xué)特征與主動外排泵耐藥系統(tǒng)的關(guān)系；為指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，監(jiān)測和控制耐藥菌株的播散提供實驗依據(jù)。本研究分為三個部分：
　　 ㈠多重耐藥鮑曼不動桿菌主動外排表型的檢測及其主動外排泵編碼基因分析。
　　 方法：標(biāo)本為2006

3、-2008年來源于我院患者體內(nèi)分離后留有菌種的耐藥鮑曼不動桿菌共23株，其中2006年8株，2007年3株，2008年12株；1株為質(zhì)控標(biāo)準參考菌株ATCC27853。菌種鑒定采用Vitek32系統(tǒng)。采用瓊脂二倍法測定外排泵抑制劑(奧美拉唑、利血平和氰氯苯腙)對抗菌藥物對抗多重耐藥鮑曼不動桿菌活性的影響，以加入泵抑制劑后抗生素MIC下降≥4倍為陽性標(biāo)準，提示存在主動外排機制，并應(yīng)用PCR和DNA測序技術(shù)進一步了解主動外排泵的編碼基因。<

4、br>　　 結(jié)果：外排泵抑制劑奧美拉唑、利血平、氰氯苯腙(CCCP)三者均對鮑曼不動桿菌外排泵有抑制作用，但抑制強度不一，以CCCP作用最強，而奧美拉唑作用最弱。加入CCCP篩選出鮑曼不動桿菌外排泵的陽性株為16株，陽性率為69.6％，而利血平和奧美拉唑分別篩選出4、2株，陽性率僅為17.4％、8.7％。以AdeB為引物經(jīng)PCR技術(shù)擴增主動外排泵編碼基因，PCR檢測結(jié)果為16株陽性，經(jīng)測序分析后，證實為AdeB主動外排泵編碼基因，其中

5、11株同樣為CCCP篩選出的陽性菌株。
　　 結(jié)論：從2006-2008年本院住院患者體內(nèi)分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥機制存在主動外排系統(tǒng)的參與，其基因型主要為AdeB型。CCCP、利血平和奧美拉唑均對主動外排泵有抑制作用，但CCCP更適合作為篩選鮑曼不動桿菌主動外排泵的抑制劑。
　　 ㈡多重耐藥鮑曼不動桿菌主動外排泵表達量的檢測。
　　 方法：標(biāo)本為第一部分所調(diào)查的PCR檢測主動外排泵編碼基因陽性的菌株，共

6、16株。運用RT-PCR技術(shù)檢測主動外排泵adeB及adeRS基因的表達量。
　　 結(jié)果：PCR檢測陽性的菌株中有14株RT-PCR檢測結(jié)果為陽性，即有adeRS、adeB的轉(zhuǎn)錄表達，呈現(xiàn)為a、b、d、g和i共5種耐藥模式；編號2535號及編號2631號菌株P(guān)CR檢測結(jié)果為陽性，RT-PCR檢測結(jié)果為陰性，但CCCP檢測結(jié)果為2535號菌株為陰性，2631號CCCP檢測結(jié)果為陽性；編號519、2884、8865和13140號菌株

7、PCR和RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性，但CCCP檢測結(jié)果均為陰性。
　　 結(jié)論：本次研究所調(diào)查的多重耐藥鮑曼不動桿菌的主動外排泵表達程度不盡相同，說明CCCP作為篩選鮑曼不動桿菌主動外排泵的抑制劑時不一定能全部反應(yīng)細菌外排泵情況。
　　 ㈢ERIC2-PCR分析多重耐藥鮑曼不動桿菌的同源性。
　　 方法：標(biāo)本為第一部分所調(diào)查2006-2008年來源于我院患者體內(nèi)分離后留有菌種的耐藥鮑曼不動桿菌共23株，菌種鑒定采

8、用Vitek32系統(tǒng)。分子流行病學(xué)分型采用ERIC-PCR分型。基因組指紋圖譜結(jié)果用BioNumerics4.6I軟件分析，凡相似度的值大于80％者被歸為一克隆株。
　　 結(jié)果：23株鮑曼不動桿菌可劃分為7種基因型，分別描述為A、B、…F、G型，以A型最多，有12株，占52.2％，且可分為2個亞型A1和A2，其中A1亞型有5株，主要分布在內(nèi)科系統(tǒng)，標(biāo)本來源以痰為主，在06、08年檢出；A2亞型有7株，主要分布在外科系統(tǒng)及重癥監(jiān)護