整合子介導(dǎo)鮑曼不動桿菌多重耐藥分子機制.pdf

1、[研究背景]：鮑曼不動桿菌已成為引起嚴重致死性院內(nèi)感染重要病原菌，常表現(xiàn)為對多種抗菌藥物耐藥即多重耐藥，易引起醫(yī)院獲得性肺炎、菌血癥、泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎、軟組織感染以及腹腔內(nèi)感染等嚴重感染。特別是近年國內(nèi)外報道耐碳青霉烯類多重耐藥鮑曼不動桿菌，在重癥監(jiān)護病房、血液病房引起爆發(fā)流行，病死率高。鮑曼不動桿菌感染治療越來越困難，臨床治療面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。因此加強對其耐藥性監(jiān)測，研究其耐藥分子機制，對于控制和治療鮑曼不動桿菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染具

2、有重要的現(xiàn)實意義。 [目的]：篩選臨床分離鮑曼不動桿菌中多重耐藥菌株，測定其耐藥表型；測定多重耐藥菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的表型和基因型；對臨床分離鮑曼不動桿菌中含整合酶分布狀況進行研究，用PCR方法測定鮑曼不動桿菌中整合酶基因及類型；測定整合子可變區(qū)耐藥基因，分析整合子結(jié)構(gòu)，探討整合子陽性菌株中耐藥基因?qū)︴U曼不動桿菌耐藥表型的影響。 [方法]：(1)利用常規(guī)紙片擴散藥敏試驗從北京地區(qū)醫(yī)院臨床分離的82株鮑曼不動桿菌中篩選出多

3、重耐藥的菌株(至少對兩種及兩種以上抗菌藥物耐藥)，采用瓊脂二倍稀釋法檢測24種抗菌藥物對82株鮑曼不動桿菌的耐藥表型。(2)采用改良三維試驗，PCR擴增及DNA測序等方法測定耐藥菌株的AmpC酶和ESBLs、碳青霉烯酶的表型及基因型。用RAPD分型方法分析耐藥鮑曼不動桿菌的基因同源性，分析產(chǎn)酶情況不同的菌株在耐藥表型方面的差異。初步探討耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌多重耐藥機制。(3)設(shè)計3類整合酶基因特異性引物(IntI1，2，3)進行PC

4、R擴增反應(yīng)和DNA測序，測定82株鮑曼不動桿菌中整合酶基因及類型，分析整合子陽性菌株在耐藥表型方面的差異。(4)以整合酶陽性的菌株為研究對象，用PCR擴增和DNA測序方法測定整合子可變區(qū)基因盒，通過PCR擴增測序產(chǎn)物結(jié)果直接在GeneBank上進行序列比對分析，了解內(nèi)插耐藥基因情況，分析整合子結(jié)構(gòu)。 [結(jié)果]：(1)82株不動桿菌經(jīng)常規(guī)生化反應(yīng)和Vitek系統(tǒng)進一步核查鑒定，確定為鮑曼不動桿菌。6種抗菌藥物紙片藥敏試驗結(jié)果顯示，

5、有68株細菌為多重耐藥菌株，其中耐亞胺培南菌株62株，6株為亞胺培南敏感但對其他多種抗菌藥物耐藥，單藥耐藥菌株8株，其他6株為敏感菌。68株多重耐藥鮑曼不動桿菌對24種抗菌藥物的藥物敏感性結(jié)果顯示，除左氧沙星和加替沙星耐藥率低外，其余抗菌藥物耐藥率均90％以上，對氨基糖苷類抗菌藥物、第三代頭孢菌素均100％耐藥，對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑的耐藥率在80％以上。(2)三維試驗結(jié)果顯示，68株多重耐藥菌株中，60株同時產(chǎn)AmpC酶和碳青霉

6、烯酶，5株單產(chǎn)AmpC酶，1株產(chǎn)ESBLs酶，2株僅產(chǎn)廣譜β-內(nèi)酰胺酶。所有碳青霉烯耐藥菌株均未測到金屬酶。β-內(nèi)酰胺酶基因型PCR測定結(jié)果顯示，均測到TEM-1型廣譜β-內(nèi)酰胺酶，未測到SHV、CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶。1株產(chǎn)ESBLs細菌的基因型不是TEM、SHV變異型、CTX-M型，是否為其他基因型尚待進一步探討。62株亞胺培南耐藥菌株中除2株細菌外，60株菌株均測到碳青霉烯酶OXA-23基因型，未測到OXA-24及金屬酶(IMP

7、和VIM型)。60株同時產(chǎn)碳青霉烯酶和AmpC多重耐藥鮑曼不動桿菌對24種抗菌藥物的敏感性結(jié)果顯示，除加替沙星耐藥率低外，對哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢哌酮、氨芐西林/舒巴坦、替卡西林/克拉維酸100％耐藥，對其他抗菌藥物耐藥率均90％以上。RAPD結(jié)果顯示，68株多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株中分7個克隆株，其中A型5株、B型8株，C型5株，D型46株，E型2株，F(xiàn)型1株，G型1株。(3)對68株多重耐藥菌株整合酶基因測定結(jié)果顯示，19株(27

8、.9％)Ⅰ類整合酶基因擴增陽性，其中B型克隆株中8株，C型克隆株3株，D型克隆株8株，在GeneBank上經(jīng)Blast比對結(jié)果100％與AJ640197.1同源。未測到Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因。同時也對8株單藥耐藥和6株敏感鮑曼不動桿菌菌株整合酶基因進行整合酶基因測定，結(jié)果均未測到整合酶基因。在1類整合子陽性和陰性菌株的耐藥性的對比分析中發(fā)現(xiàn)，整合子陽性菌株對氨基糖苷類、磺胺類等抗菌藥物耐藥率菌明顯高于整合子陰性菌，提示整合子對細菌耐藥性的播

9、散有重要的作用。(4)對19株整合酶陽性菌株進行可變區(qū)PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)13株(68.1％)出現(xiàn)6種不同長度DNA片段(1.3-3kb)，其中7株出現(xiàn)2476bp條帶，測序結(jié)果為含4個開放讀碼框，GeneBank序列比對結(jié)果與aacC1、orf1、orfx’和aadDA1100％同源，對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥，登錄號為AJ784787.1；2株Aba-b04和Aba-38為2235bp，測序和序列比對結(jié)果含3個開放讀碼框，BlaPSE-1

10、-orfx'-aadA1，其中BlaPSE-1為編碼β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，是國內(nèi)首次在鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)，aadA1對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥；1株(Aba-b27)為含2307bp條帶，測序和序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)含3個開放讀碼框與aacA4-CatB8-aadA1100％同源，分別對氨基糖苷類抗菌藥物和氯霉素耐藥，登錄號為AY922988；1株(Aba-b32)發(fā)現(xiàn)1848bp條帶測序和序列比對結(jié)果含3個開放讀碼框與aadA2-orfF-d

11、hfrXII100％同源，分別對氨基糖苷類抗菌藥物和磺胺類抗菌藥物耐藥，登錄號為AY748453；1株(Aba-b36)發(fā)現(xiàn)1304bp條帶，測序和序列比對結(jié)果含2個開放讀碼框與aar-3-aacA4100％同源，分別對利福平和氨基糖苷類抗菌藥物耐藥，登錄號為DQ174291。1株(Aba-a48)出現(xiàn)1664bp條帶，測序和序列比對結(jié)果含2個開放讀碼框與aacA4-aadA1100％同源，對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥，登錄號為DQ1742

12、91和AY887066。另有6株未擴增出條帶，原因可能是耐藥基因片段太長無法有效擴增或3'-CS缺失。 [結(jié)論](1)北京地區(qū)醫(yī)院中多重耐藥鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類敏感性明顯下降，對其他藥物尤其是第三、四代頭孢菌素類及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑敏感性也顯著降低，同時對磺胺類、氨基糖苷類耐藥率較高。(2)多重耐藥鮑曼不動桿菌同時產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶：TEM-1酶、AmpC酶，OXA-23型碳青霉烯酶。同時產(chǎn)AmpC酶和碳青霉烯酶多

13、重耐藥菌株比例較大。耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶基因型為OXA-23型。RAPD結(jié)果顯示，68株多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株中分7個克隆株，提示多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株來源有很大差異，是由多個獨立來源發(fā)展而來的，可能與抗菌藥物選擇壓力相關(guān)。(3)19株細菌帶有Ⅰ類整合酶基因，占多重耐藥菌株27.9％。提示Ⅰ類整合子在臨床分離鮑曼不動桿菌菌株耐藥基因傳播中占有較重要地位。(4)耐藥基因盒中發(fā)現(xiàn)分別水解氨基糖苷類、氯霉素、利福平、磺胺類及

14、β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因，以氨基糖苷類耐藥基因最多見，其中BlaPSE-1是首次在鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)。(5)整合子結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)6個不同耐藥基因盒排列結(jié)構(gòu)的整合子，其中發(fā)現(xiàn)兩個新的排列BlaPSE-1-orfx'-aadA1和aacA4-aadA1，同時發(fā)現(xiàn)同一類耐藥基因aacA4可在不同菌株間檢出。提示在藥物持續(xù)選擇壓力下，不僅耐藥基因盒上耐藥基因本身發(fā)生變異，也促使整合子整合其他耐藥基因，耐藥基因盒可在不同菌株間轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致多重耐藥。(