滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)miR-21的方法學(xué)研究.pdf

1、第一部分利用超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)miR-21
　　目的:利用超分支滾環(huán)擴(kuò)增(hyper-rolling cycleamplification，HRCA)技術(shù)建立一種檢測(cè)microRNA的方法。
　　方法:1.以miR-21為研究對(duì)象，根據(jù)miR-21的堿基序列(來(lái)源于miRbase)設(shè)計(jì)特異的逆轉(zhuǎn)錄引物及鎖式探針。2.建立檢測(cè)miR-21的支鏈滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，步驟如下:miR-21逆轉(zhuǎn)錄出cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);鎖式探針環(huán)化的

2、連接反應(yīng);對(duì)已環(huán)化的探針進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。3.對(duì)超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括:鎖式探針最適濃度，鎖式探針連接時(shí)間，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間。4.通過(guò)對(duì)不同濃度的模板及不同的microRNA進(jìn)行檢測(cè)來(lái)研究本方法的靈敏度和特異性。
　　結(jié)果:通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，100nM的鎖式探針在Taq DNA連接酶作用下46℃連接30min，Bst DNA聚合酶作用下60℃反應(yīng)50min，可實(shí)現(xiàn)靶序列最大效率的擴(kuò)增。該方法特異性好，最低檢測(cè)濃度為10

3、pM。
　　結(jié)論:超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)靈敏度高、特異性好、無(wú)需特殊昂貴儀器且簡(jiǎn)單易操作，能夠應(yīng)用于microRNA的檢測(cè)。
　　第二部分滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合DNA芯片檢miR-21
　　目的:將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)與DNA芯片技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立一種檢測(cè)microRNA的固相檢測(cè)技術(shù)。
　　方法:1.以miR-21為研究對(duì)象，根據(jù)鎖式探針與模板結(jié)合的特異性堿基序列外的連接序列設(shè)計(jì)捕獲探針，用于醛基化玻片的包被。2.通過(guò)人工合成的

4、用生物素標(biāo)記的捕獲探針的互補(bǔ)探針與捕獲探針的雜交反應(yīng)來(lái)驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的捕獲探針是否能成功固定在醛基片上，并且檢測(cè)出捕獲探針的濃度為多大時(shí)固定效果最佳。3.建立檢測(cè)miR-21的芯片檢測(cè)技術(shù)，步驟如下:捕獲探針的固定，已環(huán)化的鎖式探針與捕獲探針的雜交，擴(kuò)增反應(yīng)，生物素標(biāo)記探針與RCA產(chǎn)物的雜交，親和素標(biāo)記的納米金與生物素標(biāo)記的產(chǎn)物雜交，顯色反應(yīng)。4.反應(yīng)條件的優(yōu)化，包括:捕獲探針最適固定濃度，捕獲探針最適反應(yīng)濃度，環(huán)化探針與捕獲探針最適雜交反

5、應(yīng)溫度，環(huán)化探針與捕獲探針最適反應(yīng)時(shí)間。5.通過(guò)對(duì)不同濃度的模板及不同的microRNA進(jìn)行檢測(cè)來(lái)研究本方法的靈敏度和特異性。
　　結(jié)果:人工設(shè)計(jì)的生物素標(biāo)記的捕獲探針的互補(bǔ)探針與預(yù)先設(shè)計(jì)好的并已經(jīng)按照一定濃度倍比稀釋并準(zhǔn)確點(diǎn)樣于醛基片上預(yù)先設(shè)計(jì)好的點(diǎn)樣點(diǎn)的捕獲探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，各捕獲探針固定位點(diǎn)均明顯呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)并且顏色深淺按照點(diǎn)樣濃度梯度呈一致性變化，證明我們所設(shè)計(jì)的探針準(zhǔn)確，并且發(fā)現(xiàn)捕獲探針的最佳固定濃度為5μM。通過(guò)對(duì)反應(yīng)