Mst1在糖尿病心肌微血管損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，截止至2015年，在全球范圍內(nèi)，糖尿病患者數(shù)量總計(jì)為4.15億人，糖尿病前期患者數(shù)量為3.18億人。根據(jù)目前每年增長(zhǎng)的速度來預(yù)計(jì)，如果不施以任何干預(yù)措施，至2040年，糖尿病患者數(shù)量總計(jì)將會(huì)達(dá)到6.42億人，而糖尿病前期人群數(shù)將達(dá)到4.81億人。近三十年來，我國(guó)糖尿病的患病率增加了17倍,從總?cè)丝跀?shù)的0.67％增長(zhǎng)至11.6%。
　　心血管（CV）并發(fā)癥在糖尿病患者的發(fā)病率和死亡率中占相當(dāng)

2、大的比例。糖尿病心血管損傷的特點(diǎn)是內(nèi)皮功能發(fā)生障礙。內(nèi)皮是心血管系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，它影響著微血管功能的許多方面，包括壓力、流量、滲透率、血管生成和血流變。糖尿病的血管內(nèi)皮發(fā)生功能障礙會(huì)導(dǎo)致微血管病的相應(yīng)臨床表現(xiàn)。然而，鮮為人知的是，與糖尿病相關(guān)的冠狀動(dòng)脈微血管損傷的機(jī)制。因此，更好地了解糖尿病的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防冠狀動(dòng)脈微血管損傷是糖尿病管理中的核心問題。
　　內(nèi)皮細(xì)胞作為葡萄糖和心肌細(xì)胞之間的屏障，在糖尿病相關(guān)的心血管疾病的發(fā)

3、病機(jī)制中起著重要的作用。在最近的研究中，自噬成為心血管疾病治療的一個(gè)潛在的新靶點(diǎn)，也有文獻(xiàn)證明了在防止糖尿病引起的腎小球硬化方面，內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞的自噬作用。然而，目前還沒有研究表明心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬在糖尿病中的作用。Mst1（哺乳動(dòng)物STE20樣激酶1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有不同的生物功能，包括細(xì)胞自噬、凋亡和氧化應(yīng)激。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在心肌梗死小鼠模型中，Mst1通過抑制自噬來促進(jìn)心臟功能障礙的發(fā)展。此外，研究也表明，通過抑

4、制Mst1基因能夠上調(diào)自噬，從而減輕梗死后心臟功能障礙。在心臟中，Mst1廣泛分布于心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。Mst1基因可以直接抑制Beclin1活性，然而，Mst1/Beclin1信號(hào)通路在糖尿病冠狀動(dòng)脈微血管損傷發(fā)展的直接作用機(jī)制并不清楚。
　　綜上所述，本研究分別從整體動(dòng)物和細(xì)胞水平探討自噬在糖尿病心肌微血管損傷中的作用以及 Mst1/Beclin1信號(hào)通路在其損傷中的作用，為糖尿病心肌病變的診治提供新的思路。
　　【目的

5、】
　　1.構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠糖尿病模型，分別觀察 Mst1基因敲除和 Mst1基因過表達(dá)的糖尿病小鼠心臟功能以及心肌微血管損傷情況。
　　2.分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別利用攜帶有 Mst1 shRNA的腺病毒和 Mst1的腺病毒干預(yù)細(xì)胞，觀察高糖條件下其對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平的影響。
　　3.明確自噬在糖尿病心肌微血管損傷中的作用，證實(shí)Mst1/Beclin1信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬在高糖誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷

6、中的作用。
　　【研究方法】
　　1.將C57和Mst1?/?小鼠隨機(jī)分為四組：正常C57小鼠組（WT），Mst1基因敲除小鼠組（Mst1?/?），糖尿病小鼠組（DM），糖尿病Mst1基因敲除小鼠組(DM+Mst1?/?)。
　　2.將非轉(zhuǎn)基因小鼠和Mst1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為四組：非轉(zhuǎn)基因小鼠組（NTg），Mst1轉(zhuǎn)基因小鼠組（Tg-Mst1），糖尿病非轉(zhuǎn)基因小鼠組（DM+ NTg），糖尿病Mst1轉(zhuǎn)基因小鼠組（DM+

7、NTg）。
　　3.按照50 mg/kg/d的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建糖尿病小鼠模型，鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射。造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)12周。
　　4.于12周末，超聲檢測(cè)各組小鼠心臟功能；掃描電鏡觀察各組小鼠心肌微血管連接的完整性（血管鑄型實(shí)驗(yàn)）。
　　5.分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，利用攜帶有Mst1 shRNA(MOI:100)的腺病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，隨機(jī)分為以下6組：
　　A.對(duì)照組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Co

8、n；
　　B.對(duì)照組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con+LacZ；
　　C. Mst1下調(diào)組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con+Ad-sh-Mst1；
　　D.高糖對(duì)照組（33 mmol/L葡萄糖）：HG；
　　E．高糖對(duì)照組（33 mmol/L葡萄糖）：HG+LacZ；
　　F．高糖Mst1下調(diào)組（33 mmol/L葡萄糖）：HG+Ad-sh-Mst1。
　　6.分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，

9、利用攜帶有Mst1(Ad-Mst1)(MOI:100)的腺病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，隨機(jī)分為以下6組：
　　A.對(duì)照組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con；
　　B.對(duì)照組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con+Ad-Control；
　　C. Mst1上調(diào)組（5.5 mmol/L葡萄糖）：Con+Ad-Mst1；
　　D.高糖對(duì)照組（33 mmol/L葡萄糖）：HG；
　　E．高糖對(duì)照組（33 mmol/L葡

10、萄糖）：HG+Ad-Control；
　　F．高糖Mst1上調(diào)組（33 mmol/L葡萄糖）：HG+Ad-Mst1。
　　7. Western blotting法檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的Mst1基因表達(dá)水平。
　　8.心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中GFP-LC3的免疫熒光檢測(cè)。
　　9.心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中 p62/aggresome的免疫熒光檢測(cè)。
　　10.透射電鏡觀察心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中自噬小體的形態(tài)及數(shù)量。

11、r>　　11. TUNEL法檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　12. JC-1染色檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體膜電位水平。
　　13. Western blotting法檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中sirt1、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白分子表達(dá)水平。
　　【研究結(jié)果】
　　1. Mst1基因敲除（Mst1?/?）能夠改善糖尿病小鼠的心功能障礙，能夠改善糖尿病小鼠心肌微血管內(nèi)皮連接的完整性。

12、r>　　2.過表達(dá)Mst1基因能夠加重糖尿病小鼠的心臟功能障礙，能夠加重糖尿病小鼠心肌微血管內(nèi)皮連接完整性的破壞。
　　3. Mst1基因敲除可以上調(diào)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平，降低p62/aggresome的聚集，促進(jìn)細(xì)胞自噬小體的生成，抑制高糖培養(yǎng)下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，并且能夠改善心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體膜電位水平。
　　4.過表達(dá) Mst1基因可以下調(diào)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中 LC3的表達(dá)，增加細(xì)胞中p62/ag

13、gresome的聚集，抑制細(xì)胞中自噬小體的生成，增加高糖培養(yǎng)下細(xì)胞的凋亡水平，并且能降低心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體膜電位水平。
　　5. Western結(jié)果顯示：Mst1基因的下調(diào)可以使 sirt1和 Beclin1蛋白的表達(dá)顯著增多；可以促進(jìn) LC3-Ⅱ表達(dá)，抑制 p62表達(dá)；可以引起自噬流的增強(qiáng)，BAF中LC3-II/LC3-1比值增加，p62表達(dá)降低。
　　6. Western結(jié)果顯示：Mst1基因的上調(diào)可以抑制sir

14、t1和Beclin1蛋白的表達(dá)；可以抑制LC3-Ⅱ表達(dá)，促進(jìn)p62表達(dá)；可以抑制自噬流，BAF中LC3-II/LC3-1比值減少，p62表達(dá)增多。
　　【結(jié)論】通過本實(shí)驗(yàn)，成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠糖尿病模型并分離培養(yǎng)出了小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了Mst1基因敲除能減輕糖尿病導(dǎo)致的心功能障礙，減輕心肌微血管的病理損傷，增加心肌的自噬水平；Mst1過表達(dá)可以加重糖尿病導(dǎo)致的心功能障礙，加重心肌微血管的病理損傷，降低心肌的自噬水平，其機(jī)