轉(zhuǎn)錄因子GATA-3在大鼠單側(cè)腎臟梗阻模型中的表達.pdf

1、研究顯示腎間質(zhì)病變與慢性腎功能衰竭進展關(guān)系密切，腎間質(zhì)纖維化幾乎是各種腎臟疾病進展到終末期的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。研究其病理過程和發(fā)生機制，尋找延緩和阻斷腎臟纖維化新靶標，是目前國內(nèi)外腎臟病研究的熱點方向。其中腎臟纖維化過程中，多種細胞因子和生物活性物質(zhì)參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展：轉(zhuǎn)化生長因子等纖維化的正性調(diào)節(jié)因子，及肝細胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等纖維化的負向調(diào)節(jié)因子通過生物信號傳導機制鏈接起來，形成完善的反饋系統(tǒng)，調(diào)節(jié)機體的病理生

2、理過程。但研究得最多和最為成熟的是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1在腎臟纖維化中的作用機制。 而纖維化最顯著特征是肌成纖維細胞的增生和細胞外基質(zhì)（extracelluarmatrix，ECM）的過度沉積?；旧媳憩F(xiàn)出相似的特征，即大量的成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞。腎纖維化的細胞機制即是成纖維細胞激活為肌成纖維細胞（myofibroblast，MF），腎間質(zhì)纖維化的主要特征是出現(xiàn)MF，MF是腎間質(zhì)纖維化中產(chǎn)生基質(zhì)蛋白的主要效應(yīng)細胞。腎纖

3、維化中，MF可來源于：（1）腎間質(zhì)成纖維細胞；（2）血管平滑肌細胞；（3）腎小管上皮細胞。其中腎小管上皮細胞是MF的主要來源。纖維蛋白形成的自分泌過程和成纖維細胞和肌纖維母細胞來源的TGF-β1，持續(xù)刺激上皮細胞轉(zhuǎn)化成為間充質(zhì)細胞（epithelial-to-mesenchymal transition EMT），這成為纖維化過程中的一個重要機制。 所以腎臟纖維化過程中TGF-β1成為公認的致纖維化因子：其活化過程主要是與細胞膜

4、表面的TGF-βⅡ型受體結(jié)合，形成二元復合物，TGF-βⅠ型受體識別并結(jié)合該二元復合物?；罨腡GF-βⅠ型受體進一步作用于細胞內(nèi)的下游分子是途徑限制性Smad蛋白（Smad2和Smad3），使TGF-β的信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導；通過和受體間的相互作用，TGF-β1誘導Smad蛋白磷酸化其下游信號分子Smad2/2及Smad2/3，后者與Smad4形成復合體，調(diào)節(jié)靶基因的表達。Smad蛋白是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導蛋白，依據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為三型，即特異型

5、Smads（R. Smads），包括Smad1、2、3、5和8；公共調(diào)節(jié)型Smads（C. Smads），即Smad4；抑制型Smads（Ⅰ. Smads），包括Smad6、7。其中Ⅰ.Smad具有負調(diào)控作用，在磷酸化的R.Smad和Smad4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下Ⅰ.Smad表達增高，而Ⅰ.Smad通過其結(jié)構(gòu)域與活化的TGF-βⅠ型受體結(jié)合，使R.Smad不能與TGF-βⅠ型受體結(jié)合，從而抑制R.Smad磷酸化，阻止受體復合物的形成及轉(zhuǎn)位入核；

6、也可通過一些調(diào)節(jié)蛋白如Smad泛素調(diào)節(jié)因子降解TGF-βⅠ型受體進而抑制信號傳導。 Smad蛋白2和3在人近端小管上皮細胞調(diào)節(jié)TGF-β1誘導的促纖維化作用并不相同，利用RNA干擾技術(shù)分別沉默Smad蛋白2和3，發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理過的人近端小管上皮細胞結(jié)締組織生長因子（CTGF），基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和α平滑肌動蛋白（α-SMA）表達上調(diào)，而上皮細胞鈣粘蛋白表達下調(diào)。TGF-β1誘導的CTGF表達上調(diào)和上皮細胞鈣

7、粘連蛋白下調(diào)具有Smad3依賴性，MMP-2上調(diào)依賴于Smad2；α-SMA的表達則依賴兩者的聯(lián)合作用。也有研究發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子通過阻斷TGF-β1誘導的EMT過程抑制纖維化形成，肝細胞生長因子對TGF-β1介導的Smad2蛋白磷酸化和隨后的核轉(zhuǎn)位過程沒有影響，對抑制性蛋白Smad6和7的表達也不起作用，它是通過特異性誘導Smad蛋白轉(zhuǎn)錄輔阻遏物SnoN和TG交互因子的表達而抑制Smad蛋白轉(zhuǎn)錄，這個發(fā)現(xiàn)說明在肝細胞生長因子受體酪氨酸

8、激酶和TGF-β1受體絲氨酸-蘇氨酸激酶之間存在一個新的信號活化過程，也說明抑制Smad蛋白轉(zhuǎn)錄修飾因子的表達也是治療腎臟纖維化一個可行的策略。 目前關(guān)于TGF-β的研究很多是從它的信號轉(zhuǎn)導途徑入手的，目前研究比較多的信號系統(tǒng)包括Smad信號通路、P38 MAPK信號通路、ERK信號通路等，其中Smad信號通路是其中研究比較透徹也是最為重要的信號通路。其中在Smad信號通路中發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）介導了腎臟負向調(diào)節(jié)

9、過程，在腎臟發(fā)育過程中，BMP-7廣泛表達于各種腎臟細胞中，主要表達于集合管、遠端腎小管、髓袢升支厚壁段和腎小球足細胞，BMP-7通過旁分泌和自分泌方式與腎小球和腎小管的Ⅱ型受體結(jié)合后再與Ⅰ型受體結(jié)合，使Ⅰ型受體磷酸化而作用于信號分子Smad1和Smad5，使Smad1/5磷酸化及與Smad4結(jié)合成復合體，移位到細胞核內(nèi)，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，引起相應(yīng)的生物效應(yīng)。BMP-7介導的信號活化smad1、5和8，而TGF-β活化Smad2和3。然后

10、這些活化的Smads作用于Smad4，繼而這種復合物轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄。TGF-β和BMP-7的信號通路通過正向和負向的調(diào)節(jié)機制緊密聯(lián)系在一起：其中一個很重要的負向反饋機制為抑制性Smads（Smad6/7）蛋白的產(chǎn)生。Smad6優(yōu)先抑制BMP的信號通路，Smad7則抑制TGF-β/activin的信號通路。Smad7通過蛋白酶體家族成員E3-ubiquitin酶結(jié)合產(chǎn)生遍在蛋白化作用和降解TGF-β受體發(fā)揮作用；同時還

11、阻斷了Smad2和Smad3蛋白的磷酸化，使得TGF-β的信號轉(zhuǎn)導過程受阻，成為TGF-β的負反饋機制環(huán)路。減少Smad7蛋白的表達在單側(cè)輸尿管梗阻模型中導致了小管間質(zhì)性的纖維化。TGF-β通過Smad3/4，AP-1，SP1，和TFE3調(diào)節(jié)的Smad蛋白結(jié)合位點誘導Smad7的表達；BMP-7則是通過多重的BMP反應(yīng)原件（BRE）誘導Smad7的表達。其中有兩個低親和力的位點：BRE-1/2在BMP高濃度是被激活，還有一個高親和力的位

12、點Ⅰ-BRE在BMP低濃度時就可被激活。BRE-1/2和Smad1/4復合物結(jié)合、Ⅰ-BRE和Smad1/4/GATA結(jié)合。這提示轉(zhuǎn)錄因子GATA可能增強Smad7介導的阻斷TGF-β信號通路過程，同時在BMP低濃度時就誘導Smad7的產(chǎn)生從而啟動腎臟纖維化負反饋調(diào)節(jié)機制。目前國內(nèi)和國際上關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的研究主要集中在肺臟及肝臟等器官上，鄧群益等通過對大鼠哮喘模型的研究發(fā)現(xiàn)：GATA-3反義寡核苷酸能特異性地抑制GATA-3基

13、因的表達，減輕氣道炎癥反應(yīng)。American Journal of Pathology上的一篇文獻進一步支持了該理論，這篇文獻提示GATA-3的過表達增加了肺臟纖維化的發(fā)展過程，可能是通過減少了干擾素-r的產(chǎn)生而發(fā)揮作用，但是關(guān)于GATA-3在腎臟組織的表達情況及其對腎臟纖維化進程中信號通路的影響國內(nèi)外未見相關(guān)報道，對其他纖維化因子TGF-β、BMP-7的影響也未進一步探究；所以本研究利用GATA-3反義寡核苷酸在基因水平上封閉GATA

14、的表達，在基因和組織水平上檢測GATA-3的表達水平的改變情況，觀察BMP-7和Smad7的表達變化，探討其中的機制，以便為纖維化疾病的治療和研究提供有益的啟示。 目的： 1.觀察在單側(cè)腎臟梗阻模型中轉(zhuǎn)錄因子GATA-3在不同處理因素大鼠腎臟中的表達情況，了解它在腎臟纖維化進程的作用； 2.在動物水平上初步探討轉(zhuǎn)錄因子GATA-3反義寡核苷酸藥物的干預(yù)意義； 研究方法： 1.將36只雄性SPF級W

15、istar大鼠隨機分為單側(cè)輸尿管梗阻組（Unilateral Ureteral Obstruction group UUO）和正常對照組，單側(cè)輸尿管梗阻組按照處理因素再分為GATA-反義寡核苷酸組（antisense oligonucleotide group AS），GATA-3無意義寡核苷酸組（nonsen3 se oligonucleotide group NS）和生理鹽水組，每組各6只。正常對照組18只大鼠采取同樣的分組方法。分

16、別在試驗第1、7、14d處死每小組2只大鼠，HE和Masson染色觀察腎臟纖維化的病理變化并評估纖維化程度。 2.采用SABC法檢測GATA-3、Smad7、BMP-7、TGF-β1的陽性表達情況并統(tǒng)計面積。 3.RT-PCR方法觀察大鼠腎臟組織GATA-3及Smad7 mRNA表達同時計算灰度值。 4.實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計，采用完全隨機分組多因素析因設(shè)計

17、和方差分析方法進行統(tǒng)計分析，相關(guān)性分析用Sperrman相關(guān)系數(shù)進行分析。 結(jié)論： 1.在腎臟纖維化過程中GATA-3在其中的信號通路中也發(fā)揮了作用； 2.反義寡核苷酸通過封閉GATA基因的表達，阻斷高親和力位點Ⅰ-BRE和BRESmad1/4/GATA的結(jié)合，減少BMP-7誘導的Smad7表達； 3.轉(zhuǎn)錄因子GATA-3反義寡核苷酸經(jīng)過反復和長時間的給藥基本上達到了有效的藥物濃度，并且和GATA-3的結(jié)