日本血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白SjWnt4、SjWnt10a編碼基因的克隆、表達(dá)及其生物學(xué)功能分析.pdf

1、血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)感染引起的分布廣泛、危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病.血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體呈現(xiàn)不同的基因差異表達(dá)模式,導(dǎo)致血吸蟲(chóng)獨(dú)特的代謝和發(fā)育過(guò)程及顯著的生物學(xué)和形態(tài)學(xué)變化.由Wnt基因家族產(chǎn)物與其它相關(guān)基因產(chǎn)物所構(gòu)成的Wnt信號(hào)通路,是細(xì)胞發(fā)育和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的一個(gè)關(guān)鍵途徑,對(duì)動(dòng)物的發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用.本研究在日本血吸蟲(chóng)性別、期別差異蛋白質(zhì)組研究的基礎(chǔ)上,首次克隆了2個(gè)編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Wnt的基因,并對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了表達(dá)及生物學(xué)功能研

2、究. 作者首先利用本實(shí)驗(yàn)室在雙向電泳結(jié)合肽質(zhì)量指紋圖譜分析基礎(chǔ)上獲得的1個(gè)Wnt家族蛋白的一段肽序列,以此肽序列為詢問(wèn)序列在日本血吸蟲(chóng)EST庫(kù)中搜索到2個(gè)日本血吸蟲(chóng)的相應(yīng)EST片段(GenBank登錄號(hào)AAM89872、AY811118).根據(jù)EST序列,利用RACE技術(shù)首次克隆獲得日本血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Wnt4編碼基因研wnt4(GenBank登錄號(hào)DQ643829)和Wnt10a編碼基因Sjwnt10a(GenBank登錄號(hào)

3、DQ643830). 生物信息學(xué)分析表明這兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)具有十分典型的Wnt家族蛋白特征:整個(gè)蛋白序列中散在著100多個(gè)Wnt家族蛋白的保守位點(diǎn);有23～24個(gè)可交連形成二硫鍵的保守的半胱氨酸殘基,其中50﹪位于蛋白的羧基端;具有三個(gè)或四個(gè)糖基化位點(diǎn).序列分析表明研wnt4基因的ORF含1311bp,編碼436個(gè)氨基酸,理論分子量49.6kD,該基因編碼的氨基酸序列與日本三角渦蟲(chóng)的Wnt4相似性達(dá)43﹪,與人Wnt4的相似

4、性為37﹪.實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示該基因在14天童蟲(chóng)、19天童蟲(chóng)、31天成蟲(chóng)、44天雌蟲(chóng)及44天雄蟲(chóng)中均有表達(dá),其中19天童蟲(chóng)中的表達(dá)量明顯高于其它發(fā)育階段,44天雌蟲(chóng)中的表達(dá)量明顯高于雄蟲(chóng).成功構(gòu)建了該基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-Sjwnt4,應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá),重組蛋白以包涵體形式存在,分子量為76kD,Westem blotting顯示表達(dá)產(chǎn)物能被日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原免疫兔血清所識(shí)別,具有良好的抗原性.Sjwnt1

5、0a基因的ORF含1896bp,編碼631個(gè)氨基酸,理論分子量73.3kD.該基因編碼的氨基酸序列與人、鼠的Wnt10a的氨基酸序列相似性都為26﹪.實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示該基因在日本血吸蟲(chóng)19天童蟲(chóng)中表達(dá)量最高,在14天童蟲(chóng)和44天雄蟲(chóng)中也有表達(dá),但分別僅為19天童蟲(chóng)表達(dá)量的8.8﹪和5﹪,而在31天成蟲(chóng)和44天雌蟲(chóng)中沒(méi)有檢測(cè)到該基因. 本文利用RNAi技術(shù)對(duì)Sjwnt4基因表達(dá)進(jìn)行了初步地探索,成功篩選出具有較高干擾效果的s

6、iRNA小分子S499,抑制率達(dá)到86.4﹪,為后續(xù)試驗(yàn)打下基礎(chǔ).應(yīng)用重組蛋白rsjWnt4.免疫BALB/c小鼠,獲得了19.90﹪的減蟲(chóng)率和20.58﹪的肝組織減卵率. 本論文率先開(kāi)展了血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Wnt的研究,首次獲得兩個(gè)編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Wnt的基因,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在童蟲(chóng)期高表達(dá);成功將Sjwnt4在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),在小鼠中初步評(píng)估了重組蛋白誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果;成功篩選出對(duì)Sjwnt4基因具有干擾作用的siRN