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1、目的 本研究擬根據(jù)人腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)基因序列設(shè)計(jì)小發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA),構(gòu)建高效真核表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)染人滑膜細(xì)胞觀察其表達(dá),探討通過RNA干擾(RNAinterference,RNAi)抑制TNF基因表達(dá)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis, RA)的可行性。 方法 根據(jù)GeneBank中人TNF mRN
2、A全長(zhǎng)開放讀框(NM_000594),設(shè)計(jì)擴(kuò)增人TNF完整開放讀框序列的PCR引物、探針及干擾序列。以復(fù)合陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo),重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人滑膜細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染后12h、24h、48h、72h和第7d細(xì)胞培養(yǎng)上清液,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNF表達(dá)量,分析重組真核載體的轉(zhuǎn)染表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05作為差別有顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果 人腫瘤壞死因子真核表達(dá)載體p
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