骨髓增生異常綜合征骨髓造血細(xì)胞分化異常及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：對(duì)骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic Syndrome，MDS)患者骨髓造血細(xì)胞的分化異常進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其分化異常的部分相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究；同時(shí)進(jìn)一步尋找MDS惡性克隆細(xì)胞，并探討其過度增殖、分化異常及凋亡逃逸等惡性特征。
　　 方法：研究對(duì)象為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院自2008年7月至2010年10月新診斷的MDS患者62例、MDS轉(zhuǎn)化的急性髓系白血病(MDS-AML)8例、急性髓系白血病(AML)7例、病例對(duì)照

2、組16例及正常對(duì)照32名。第一部分檢測(cè)MDS患者骨髓造血細(xì)胞分化異常情況，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)MDS患者骨髓粒系、單核系及紅系分化抗原；干細(xì)胞分群；單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞周期分布，并分析分化異常情況與染色體惡性克隆負(fù)荷的相關(guān)性。第二部分研究導(dǎo)致MDS患者骨髓造血細(xì)胞分化異常的相關(guān)機(jī)制，采用FCM檢測(cè)MDS患者干/祖細(xì)胞表面干細(xì)胞因子受體(SCF-R)、紅細(xì)胞生成素受體(EpoR)、粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSFR)及血小板生成素受體

3、(TpoR)的表達(dá)情況，并分析其臨床意義；干/祖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、GATA-2的表達(dá)情況；RT-PCR的方法檢測(cè)GATA-1基因在MDS患者骨髓中的表達(dá)情況。第三部分尋找MDS惡性克隆細(xì)胞，檢測(cè)MDS患者骨髓干細(xì)胞中白細(xì)胞介素-3受體α(IL-3Rα)表達(dá)情況，并探討IL-3Rα陽性細(xì)胞的異常增殖及分化特征。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分、粒系細(xì)胞分化抗原表達(dá)的模式和比例
　　 選擇CD13/CD11b、

4、CD13/CD16及CD11b/CD16組合來分析粒細(xì)胞分化抗原表達(dá)模式，對(duì)照組和病例對(duì)照組骨髓粒系細(xì)胞組合模式分別為“對(duì)鉤”、“鐮刀”或“反7”狀，MDS患者骨髓粒系細(xì)胞發(fā)育分化中的抗原表達(dá)失去正常序貫表達(dá)模式，呈現(xiàn)抗原的連續(xù)性表達(dá)中斷等不同程度的改變。高危組CD11b-/CD11b+比值(0.32±0.29)明顯高于低危組(0.16±0.23)、病例對(duì)照組(0.05±0.03)及正常對(duì)照組(0.07±0.05，P<0.01)；高危組

5、CD16-/CD16+比值(1.32±0.77)明顯高于病例對(duì)照組(0.33±0.32)和正常對(duì)照組(0.39±0.31，P<0.05)；高危組骨髓粒細(xì)胞CD13的平均熒光強(qiáng)度(MFI)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，側(cè)向角散射光信號(hào)(SSC)的MFI明顯低于病例對(duì)照組和正常對(duì)照組(P<0.01)。高危組CD11b-HLA-DR+(4.08％±2.97％)、CD11b-HLA-DR-(14.90％±15.44％)、CD16-HLA-

6、DR-(38.98％±21.59％)、CD11b+CD16-(32.57％±16.52％)及CD13+CD16-(43.97%±20.31％)細(xì)胞占粒細(xì)胞比例明顯高于低危組、病例對(duì)照組及對(duì)照組(P<0.05)，其他組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單核系細(xì)胞分化抗原表達(dá)的模式和比例：選擇CD13/CD16和CD11b/HLA-DR組合來分析單核細(xì)胞分化抗原表達(dá)模式，MDS患者骨髓單核系細(xì)胞發(fā)育分化中的抗原表達(dá)模式相對(duì)于對(duì)照組的序貫組合模式出現(xiàn)不

7、同程度的改變。高危組CD11b-HLA-DR+(12.38％±8.97％)、CD11b+HLA-DR-(38.33％±18.43％)細(xì)胞占單核系細(xì)胞比例明顯高于病例對(duì)照組和正常對(duì)照組(P<0.05)。高危組單核細(xì)胞CD14(56.74％±17.73％)表達(dá)率明顯低于正常對(duì)照組，CD64的表達(dá)率各組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD56(32.45％±20.07％)、CD34(13.54％±13.73％)及CD7(15.31％±12.76％

8、)表達(dá)率明顯高于病例對(duì)照組及正常對(duì)照組。紅系細(xì)胞分化抗原表達(dá)的模式和比例：應(yīng)用CD71和血型糖蛋白A(glycophorin A，GlyA)的組合來分析紅系細(xì)胞的分化，對(duì)照組和病例對(duì)照組兩種抗原的組合模式均為雙陽性表達(dá)，部分MDS患者可見CD71和GlyA表達(dá)不同步現(xiàn)象。低危組和高危組CD71+、GlyA+細(xì)胞占CD45-細(xì)胞的比例均顯著低于病例對(duì)照組和正常對(duì)照組(P<0.05)，CD71+GlyA+雙陽性細(xì)胞分別占CD45-、CD71

9、+細(xì)胞的比例均顯著低于病例對(duì)照組和正常對(duì)照組(P<0.05)，CD71+GlyA+雙陽性細(xì)胞占GlyA+細(xì)胞的比顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)。MDS患者粒系、單核系及紅系抗原表達(dá)的比例和模式的異常數(shù)目與IPSS(國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng))積分(r=0.662，P=0.000)、WPSS(WHO分型預(yù)后積分系統(tǒng))積分(r=0.602，P=0.000)及惡性克隆負(fù)荷(r=0.477，P=0.001)均呈正相關(guān)。高危和MDS-AML組骨髓CD3

10、4+細(xì)胞比例(2.29%±2.17％、18.69±17.47％)明顯高于對(duì)照組(0.36％±0.49％，P<0.05)。低危、高危及MDS-AML組CD34+CD38+細(xì)胞相對(duì)比例(86.09％±7.79％、81.68％±11.82％、82.88％±2.60％)顯著低于對(duì)照組(92.21％±3.85％，P<0.05)，而CD34+CD38-細(xì)胞比例(13.91％±7.79％、18.32％±11.82％、17.13％±2.60％)顯著高于

11、對(duì)照組(7.79％±3.85％，P<0.05)。MDS組CD34+CD38-細(xì)胞比例與IPSS(r=0.493，P=0.001)、WPSS積分(r=0.586，P=0.000)均呈正相關(guān)。CD34+CD38-細(xì)胞比例≤12.0％的MDS患者治療有效率高于CD34+CD38-細(xì)胞比例>12.0％的患者，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低危、高危及MDS-AML組單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)中G0/G1期細(xì)胞比例(94.52％±4.32％，96.07％±3.

12、88％，94.65％±4.55％)明顯高于對(duì)照組(88.94％±7.30％，P<0.01)，而3組患者S期(4.63％±3.34％，3.45％±3.80％，5.12％±4.55％)和G2/M期(0.84％±1.52％，0.48%±0.74％，0.22％±0.34％)細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(9.06%±6.50％，2.00％±2.93％，P<0.05)，3組S+G2/M期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。
　　 第二部分、

13、MDS患者骨髓造血細(xì)胞造血因子受體及部分轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)
　　 對(duì)照組骨髓CD34+CD38+細(xì)胞亞群EpoR表達(dá)率(18.68％±18.34％)顯著低于CD34+CD38-細(xì)胞亞群(63.61％±19.98％，P<0.01)，兩亞群之間SCF-R、G-CSFR及TpoR表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在CD34+CD38+細(xì)胞亞群中，3組間SCF-R和TpoR表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而低危組和高危組EpoR的表達(dá)率(8.30％±6.55

14、％、7.82％±7.98％)明顯低于對(duì)照組(18.68%±18.34％，P<0.05)，G.CSFR的表達(dá)率(29.78％±19.14％、28.66%±21.14％)明顯低于對(duì)照組(44.37%±23.43％，P<0.05)；在CD34+CD38-細(xì)胞亞群中，3組間SCF-R和G-CSFR表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低危組和高危組EpoR的表達(dá)率(42.19%±21.87％、25.67％±15.64％)明顯低于對(duì)照組(63.61%±19.9

15、8％，P<0.01)，TpoR的表達(dá)率(5.42％±4.72％、4.05％±3.95％)明顯低于對(duì)照組(10.13％±8.31％，P<0.05)。MDS患者骨髓CD34+CD38+和CD34+CD38-細(xì)胞亞群表面受體表達(dá)率低的患者其外周血血紅蛋白水平、中性粒細(xì)胞及血小板計(jì)數(shù)減低的發(fā)生率明顯高于受體表達(dá)率不低的患者(均P<0.05)。在CD34+CD38+細(xì)胞亞群中，低危組和高危組GATA-1的表達(dá)率高于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高危組

16、GATA-2的表達(dá)率(12.47%±13.00％)明顯高于對(duì)照組(5.64%±7.32％，P<0.05)，余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在CD34+CD38-細(xì)胞亞群中，高危組GATA-1的表達(dá)率(28.16％±13.71％)明顯高于對(duì)照組(12.76%±14.02％，P<0.05)，低危組和高危組GATA-2的表達(dá)率(17.12％±10.61％、29.38%±7.71％)明顯高于對(duì)照組(10.07％±9.26％，P<0.05)。GATA

17、-1基因在高危組骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)中的表達(dá)量為(0.504±0.156)，顯著高于對(duì)照組(0.323±0.086，P<0.01)，余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第三部分、 MDS骨髓干細(xì)胞中白細(xì)胞介素-3受體α(IL-3Rα)表達(dá)情況及IL-3Rα陽性細(xì)胞增殖及分化等特征的檢測(cè)
　　 低危組、高危組及AML組CD34+CD38-細(xì)胞中CD123+細(xì)胞比例(42.48％±25.88％、51.62％±29.2

18、4％、56.19％±32.20％)明顯高于對(duì)照組(9.06％±10.04％，P<0.01)。CD123+CD34+CD38-/CD34+CD38-表達(dá)率與惡性克隆負(fù)荷呈顯著正相關(guān)(r=0.419，P=0.003)，與MDS骨髓粒系、單核系及紅系細(xì)胞分化模式和比例的異常數(shù)目呈顯著正相關(guān)(r=0.462，P=0.001)。低危組、高危組及AML組CD34+CD38-CD123+細(xì)胞中GATA-1、GATA-2及CD71表達(dá)率均明顯高于其在C

19、D34+CD38-CD123-細(xì)胞中的表達(dá)率(P<0.01)；3組CD34+CD38-CD123+細(xì)胞中EpoR表達(dá)率高于其在CD34+CD38-CD123-細(xì)胞中的表達(dá)率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3組CD34+CD38-CD123+細(xì)胞中CD11b、CD114及Annexin V表達(dá)率均明顯低于其在CD34+CD38-CD123-細(xì)胞中表達(dá)率(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)MDS患者骨髓粒系、單核系及紅系細(xì)胞

20、抗原不同步表達(dá)，表現(xiàn)為階段特異性和系別特異性的異常，諸如成熟階段細(xì)胞異常表達(dá)幼稚細(xì)胞抗原，SSC值降低即胞質(zhì)低顆?；苊擃w?，F(xiàn)象、連續(xù)性表達(dá)中斷、抗原部分表達(dá)降低＼缺失，髓系細(xì)胞異常表達(dá)淋巴系抗原等，并且由低危向高危進(jìn)展的過程中存在分化異常的積累并與IPSS、WPSS積分及惡性克隆負(fù)荷成顯著正相關(guān)。這提示分化抗原檢測(cè)可能有助于MDS患者的早期診斷和預(yù)后判斷。
　　 (2)MDS患者原代骨髓CD34+細(xì)胞亞群分化異常，CD34+C

21、D38-/CD34+比例增高，并和IPSS、WPSS積分呈正相關(guān)性；骨髓單個(gè)核細(xì)胞存在G1期阻滯現(xiàn)象，提示MDS患者造血細(xì)胞增殖分化異常，CD34+細(xì)胞亞群和細(xì)胞周期測(cè)定有助于MDS患者的輔助診斷以及療效和預(yù)后判斷。
　　 (3)MDS患者原代骨髓CD34+細(xì)胞亞群膜表面部分造血細(xì)胞因子受體表達(dá)減低，CD34+細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和GATA-2表達(dá)增高，這可能與MDS患者分化異常導(dǎo)致無效造血有關(guān)，且有望用于輔助診斷MDS