EPO通過(guò)Akt通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤體外快速增殖的作用研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬通過(guò)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的體外實(shí)驗(yàn)，研究促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是否存在促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤快速增殖的作用，并探討 AKT信號(hào)通路和細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白 CyclinD1表達(dá)的調(diào)節(jié)是否為其關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)。
　　方法：
　　本研究采用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞株，在體外成功培養(yǎng)后分為對(duì)照組、EPO處理組及EPO+蛋白激酶B（Protein Kinase B，Akt）抑制劑組。EPO處理組：在

2、U87細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入EPO（0.1U/ml）處理7天；對(duì)照組：用等體積PBS替代EPO；EPO+Akt抑制劑組：U87細(xì)胞的培養(yǎng)基中同時(shí)加入EPO（0.1U/ml）及Akt抑制劑（81.3μM）共處理7天。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測(cè)生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞倍增時(shí)間和克隆形成檢測(cè)各組細(xì)胞增殖速度，通過(guò)以上檢測(cè)EPO對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 U87細(xì)胞株增殖的影響；采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) PCR(Reverse Trans

3、cription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡（Western blotting， WB）和細(xì)胞免疫熒光法（ immunofluorescence,IF）測(cè)定CyclinD1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化，通過(guò)以上檢測(cè)EPO對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白CyclinD1表達(dá)的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPO對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞株細(xì)胞增殖周期的影響。
　　結(jié)果：
　　與對(duì)照組

4、相比，EPO處理組中U87細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯增快（P生長(zhǎng)曲線3天/5天/7天=0.020/0.028/0.007，P倍增時(shí)間=0.0269，P克隆形成=0.0010），細(xì)胞中 CyclinD1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高（ PRT-PCR=0.0186， P P-Akt=0.0020， Pβ-Cantenin=0.0026,P CyclinD1=0.0022,PIF=0.0099），流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)U87細(xì)胞的增殖指數(shù)也

5、明顯升高（ P=0.0028）；與 EPO處理組相比， EPO+Akt抑制劑組細(xì)胞CyclinD1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平明顯降低（PRT-PCR=0.0029，P P-Akt<0.0001，Pβ-Cantenin=0.0003，P CyclinD1<0.0001，PIF=0.0007），細(xì)胞增殖指數(shù)則有顯著下降（P=0.0036），同時(shí)細(xì)胞增殖能力和速度較EPO處理組顯著降低（P生長(zhǎng)曲線3天/5天/7天=0.000/0.001/0.