吉西他濱與順鉑對人肺癌A549細(xì)胞的作用研究.pdf

1、肺癌是對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一,在眾多的治療方法中,化療是治療非小細(xì)胞肺癌NSCLC最主要的手段,而吉西他濱(Gemcitabine,GEM)是其中最有效的化療藥之一。順鉑(Cisplatin,CDDP)屬細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥,是應(yīng)用最廣泛的抗癌藥物之一。其特點(diǎn)是抗癌作用強(qiáng),抗癌活性高,與其他抗癌藥物無交叉耐藥性,因而常與其他藥物配合使用。許多體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)吉西他濱與順鉑兩藥聯(lián)用化療藥效明顯高于單藥,二者之間存在

2、協(xié)同和相加作用。隨著藥物的聯(lián)用,由于藥物濃度的變化而引起的不良反應(yīng)和副作用也隨之而來,如何在不增加藥物劑量的前提下通過調(diào)整用藥順序達(dá)到最佳效果迅速成為學(xué)者們研究的焦點(diǎn),不同時(shí)序下給藥的劑量,用藥時(shí)間及兩藥相互作用的具體機(jī)制尚都需要深入的研究,目前,吉西他濱與順鉑聯(lián)用的GP方案在肺腺癌中的臨床應(yīng)用顯示了良好的前景,優(yōu)化最佳時(shí)序組合方式為臨床提供選擇尤顯重要。本研究使用人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549做為研究對象,探討了在不同的給藥時(shí)序下的細(xì)胞學(xué)作用

3、機(jī)制,為臨床更好的治療NSCLC提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1、藥品:注射用鹽酸吉西他濱(澤菲)、順鉑注射液均由江蘇豪森藥業(yè)公司提供。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng):人肺腺癌A549細(xì)胞系用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37℃,5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 3、四甲基偶氮唑鹽(tetrazolitim,MTT)法檢測細(xì)胞增殖能力取對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),稀釋至密度5×104個(gè)/

4、ml,分別接種于4個(gè)96孔板培養(yǎng)板,每孔加入100ul細(xì)胞懸液,即每孔接種5000個(gè)細(xì)胞。接種24小時(shí)后加入各種處理因素。處理后第24、48、72、96小時(shí)分別加入MTT(5mg/ml)20μl,繼續(xù)孵育4小時(shí)后,每孔加入150μl DMSO溶解結(jié)晶,選擇波長490 nm在酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測儀上測定各孔吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。繪制細(xì)胞生長曲線。
　　 4、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期
　　 收集不同處理因素的對數(shù)生長期細(xì)

5、胞制成1×107個(gè)/ml細(xì)胞懸液。PBS洗滌,取1ml細(xì)胞懸液75％冷乙醇于4℃固定過夜、離心后棄上清制成500μl的細(xì)胞懸液,加碘化丙啶染液(PI)于4℃避光孵育45分鐘后用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測,ModFitLT3.0軟件分析細(xì)胞周期。
　　 5、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡
　　 收集不同處理因素的對數(shù)生長期細(xì)胞制成1×107個(gè)/ml細(xì)胞懸液。PBS洗滌,加入ANNEXIN V-FITC和PI染料,避光處

6、理,使甩FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況,計(jì)算細(xì)胞凋亡百分率。
　　 6、統(tǒng)計(jì)分析:使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示的數(shù)據(jù),其實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、吉西他濱或順鉑單藥對A549細(xì)胞的抑制作用
　　 根據(jù)兩種藥物血漿峰濃度選擇不同濃度梯度單藥作用于A549,取24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)為時(shí)間點(diǎn)檢測,所

7、得結(jié)果用于計(jì)算單藥的半數(shù)抑制濃度IC50。吉西他濱作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的IC50分別為3.79±0.32 mg/L、1.11±0.12mg/L、0.23±0.06mg/L,72小時(shí)的IC50約為24小時(shí)的16倍;順鉑作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的IC50分別為18.58±2.01mg/L、3.78±0.25 mg/L、0.76±0.10 mg/L,且隨濃度增大抑制作用增大呈量效關(guān)系。
　　 2、吉西他濱和順鉑不同

8、時(shí)序給藥對A549細(xì)胞的抑制作用
　　 根據(jù)所測得的單藥作用于A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50,我們選擇固定給藥時(shí)間來檢測不同時(shí)序給藥方案對A549細(xì)胞的抑制作用。所得結(jié)果計(jì)算聯(lián)合用藥下抑制率達(dá)50％時(shí)兩藥的濃度,通過公式求得藥物聯(lián)合指數(shù)CI。先吉西他濱1天后順鉑1天CI＜1,二者為協(xié)同作用;先順鉑1天后吉西他濱1天,CI＞1兩藥為拮抗作用;吉西他濱和順鉑同時(shí)應(yīng)用,CI約等于1,兩藥為疊加作用。
　　 3、吉西他濱和順

9、鉑聯(lián)合不同時(shí)序給藥對A549細(xì)胞凋亡的影響
　　 為探討兩藥聯(lián)合作用的機(jī)理,吉西他濱和順鉑的用量為各自IC50的1:1對照組凋亡率為2.82％±0.12％;單GEM組凋亡率為14.54％±2.36％;單CDDP組凋亡率為15.06％±1.31％;先GEM后CDDP組凋亡率為25.72％±3.29％;先CDDP后GEM組凋亡率為10.99％±1.04％;GEM與CDDP同時(shí)作用組凋亡率為19.24％±3.61％。先用GEM后用CD

10、DP處理時(shí)A549細(xì)胞的凋亡率高于其他處理組(P＜0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、吉西他濱和順鉑聯(lián)合不同時(shí)序給藥對A549細(xì)胞周期的影響
　　 單藥作用時(shí)吉西他濱和順鉑都能使S期的細(xì)胞比例增多(G VS Control,C VSControl,P＜0.05),先GEM后CDDP作用下G1期和G2期的細(xì)胞比例增加(GC VSControl,P＜0.05),先CDDP后GEM作用時(shí)主要S期細(xì)胞比例增加(CG VSCon