蠟梅α-半乳糖苷梅基因CpGAL的克隆與功能初步分析.pdf

1、α-半乳糖苷酶(vGalactosidase,EC3.2.1.22)能專一的催化α-半乳糖苷鍵的水解,廣泛存在于動(dòng)植物和部分微生物中。根據(jù)其最適的pH可分為酸性α-半乳糖苷酶和堿性α-半乳糖苷酶。Α-半乳糖苷酶在食品、制糖、飼料、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。此外,α-半乳糖苷酶的表達(dá)調(diào)節(jié)和生理功能也成為植物學(xué)研究的新熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn),在促進(jìn)種子萌發(fā)與成熟、葉片的發(fā)育與衰老、果實(shí)發(fā)育與成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,同時(shí),α-半乳糖苷酶在生

2、物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)中也起著至關(guān)重要的作用。
　　 本論文在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的蠟梅花cDNA文庫(kù)并進(jìn)行EST分析的基礎(chǔ)上,通過(guò)5'RACE,得到了1個(gè)α-半乳糖苷酶基因cDNA序列。先后構(gòu)建了原核表達(dá)載體和植物表達(dá)載體,同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析,研究了該基因的組織表達(dá)及在6-BA處理下的表達(dá)特征。主要取得了以下結(jié)果:
　　 1.CpGAL的分子特征
　　 CpGAL cDNA全長(zhǎng)1376bp,其中開(kāi)放閱讀框?yàn)?/p>

3、1239bp,編碼412個(gè)氨基酸。該基因DNA分析表明其不含內(nèi)含子。序列結(jié)構(gòu)分析顯示:CpGnL編碼蛋白N端含有一個(gè)長(zhǎng)約28aa的信號(hào)肽序列,在第28與29氨基酸之間有一個(gè)明顯的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。CpGAL成熟蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由占總蛋白含量33.98%的α螺旋(Alpha helix)、占總蛋白48.54%的隨機(jī)卷曲(Radom coil)以及占總蛋白含量為17.48%的延伸鏈(Extend strand)組成。同時(shí)具有CK-2(酪蛋白

4、激酶Ⅱ)結(jié)構(gòu)域和糖基水解酶的保守序列DYLKYDNC和R***D,可能是α-半乳糖苷酶的催化活性位點(diǎn)或底物結(jié)合位點(diǎn)。
　　 2.CpGAL基因的原核表達(dá)及融合蛋白的活性檢測(cè)
　　 通過(guò)切除信號(hào)肽序列并將蠟梅α-半乳糖苷酶基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá),獲得了重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳確認(rèn)該重組蛋白以包涵體的形式存在。其分離純化采用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜,再結(jié)合超聲破碎

5、的方法,以提高包涵體的純度和回收率。利用含有8M尿素的包涵體溶解緩沖液將包涵體變性溶解,4℃高速離心后將上清透析復(fù)性,得到濃度和純度很高的重組蛋白。Α-半乳糖苷酶活性檢測(cè)證實(shí)復(fù)性后的目的蛋白具體一定的活性,溫度梯度實(shí)驗(yàn)顯示該α-半乳糖苷酶在40℃活性最高,在35-45℃時(shí),酶活力相對(duì)較高,大于45℃時(shí),酶的活性都會(huì)急劇下降。pH梯度實(shí)驗(yàn)顯示該α-半乳糖苷酶在pH6.0環(huán)境條件下活性,為酸性α-半乳糖苷酶。
　　 3.CpGAL基

6、因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平分析
　　 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明:CpGAL在蠟梅不同組織中有不同程度的表達(dá),轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在根中最多,莖、子葉、幼葉、成熟葉、盛開(kāi)的花明顯少于根;在5輪花器官中的差異也十分顯著,中瓣和雄蕊的表達(dá)量較高,具有較強(qiáng)的組織特異性;CpGAL在蠟梅單花開(kāi)放過(guò)程中呈現(xiàn)出連續(xù)的波動(dòng)態(tài)表達(dá)模式,具有較強(qiáng)的時(shí)間特異性,其轉(zhuǎn)錄水平從花芽萌動(dòng)期到蕾期下降,達(dá)到最低,隨后上升,盛開(kāi)期快速下降,衰老期大幅度上升達(dá)到峰值;6-BA處理后

7、,CpGAL在蠟梅花中的表達(dá)量均明顯減小,延緩花的衰老。轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果說(shuō)明CpGAL可能在蠟梅生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。
　　 4.CpGAL的植物表達(dá)
　　 通過(guò)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化等過(guò)程將目的基因CpGAL連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA2301g中,轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101,利用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切及PCR驗(yàn)證,表明成功構(gòu)建了目的基因的植物表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法