蠟梅CpDsbA-FrnE基因的生物特性分析及功能初步研究.pdf

1、DsbA蛋白(DisulfidebondformationproteinA)首先在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，它的主要功能是氧化新生肽鏈上的巰基形成二硫鍵。DsbA-FrnE蛋白是一個(gè)類DsbA蛋白，包含一個(gè)半胱氨酸活性位點(diǎn)(CXXC)。推測(cè)DsbA-FrnE是一個(gè)與聚酮類化合物合成有關(guān)的巰基氧化酶。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室已建立的蠟梅(Chimonanthuspraecox(linn.)Link)花cDNA文庫的基礎(chǔ)上，以文庫克隆載體pTri

2、plex2的通用引物隨機(jī)克隆測(cè)序，獲得一個(gè)大約1200bp的特異性片段。運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行分析，確定從蠟梅文庫中獲得的片段包含蠟梅CpDsbA-FrnE基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為CpDsbA-FrnE,該基因的cDNA全長(zhǎng)包含一個(gè)654bp的開放閱讀框(ORF)，編碼217個(gè)氨基酸。該基因編碼蛋白的理論分子量為24.6kD，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為5.81。
　　 本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量(realtimefluores-ce

3、ncequantitativePCR)的技術(shù)分析了CpDsbA-FrnEp基因在蠟梅不同組織、不同時(shí)期及在干旱脅迫PEG6000和42℃高溫脅迫時(shí)的表達(dá)水平，結(jié)果表明:CpDsbA-FrnE基因在蠟梅花組織中表達(dá)量高于其他組織（根、莖、葉），在盛開期的花朵中，以外瓣表達(dá)量最高;在花發(fā)育的不同時(shí)期中，露瓣期表達(dá)量最高;CpDsbA-FrnE基因能夠?qū)EG6000脅迫和42℃高溫脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，呈上調(diào)表達(dá)模式。由此推測(cè)CpDsbA-Fr

4、nE基因可能是一個(gè)跟開花及干旱、高溫等逆境脅迫有關(guān)的基因。
　　 構(gòu)建CpDsbA-FrnE基因的原核表達(dá)載體pET32a-FrnE，并在宿主菌E.colitransetta(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為:20℃，0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)14-16h，含重組質(zhì)粒的菌株transetta(pET32a-FrnE)可溶性蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。對(duì)含重組質(zhì)粒的菌株transetta(pET32a-FrnE)和對(duì)照菌株trans

5、etta(pET32a)分別進(jìn)行脅迫處理。在PEG6000和NaCl脅迫條件下的生長(zhǎng)曲線分析表明:含重組質(zhì)粒的菌株transetta(pET32a-FrnE)比對(duì)照菌株transetta(pET32a)具有更強(qiáng)的抵抗非生物脅迫的能力，初步證實(shí)CpDsbA-FrnE蛋白的體外表達(dá)提高了大腸桿菌的抗逆性。
　　 構(gòu)建植物超表達(dá)載體pC2301g-FrnE，采用基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草?；驑寘?shù)設(shè)置:可裂膜1100psi，轟擊距離12c

6、m，真空度25-26inchesHg。通過GUS組織化學(xué)染色、PCR檢測(cè)，最終篩選獲得9個(gè)株系27株的轉(zhuǎn)基因煙草。
　　 取轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草葉片利用PEG20000模擬干旱脅迫處理，4d后觀察葉片黃化情況發(fā)現(xiàn)對(duì)照煙草葉片部分黃化，轉(zhuǎn)基因煙草葉片無明顯變化。用濃度為5％的NaCl脅迫4d后觀察葉片的變化，對(duì)照煙草葉片部分黃化，轉(zhuǎn)基因型煙草葉片剛開始萎蔫。將移栽一個(gè)月后的煙草進(jìn)行NaCl脅迫處理后，進(jìn)一步測(cè)定轉(zhuǎn)基因野草可溶性糖