蠟梅expansin基因CpEXP2功能初步分析.pdf

1、Expansin基因家族是一類巨大的基因家族，主要分為α—expansin與β—expansin兩類，分別都具有很多的基因成員，廣泛的存在于多種植物中，目前已有大量的expansin基因被克隆。其所編碼的擴張蛋白屬于細胞壁酶蛋白，在植物體中表達具有高度的專一性，其表達調控受到植物體自身發(fā)育進程、外源激素以及環(huán)境因子的調控。研究表明，Expansin基因對植物種子萌發(fā)、根系生長、莖、葉片生長發(fā)育、果實成熟軟化、器官脫落等等方面都起著重要作

2、用，幾乎參與了整個植物生長發(fā)育過程。 本研究在本實驗室原有研究基礎上，在蠟梅中克隆到了另外一個expansin基因，命名為cpEXP2。構建了植物表達載體，通過農桿菌介導轉化擬南芥，獲得了T1代轉基因植株：構建了原核表達載體，在大腸桿菌中表達了CpEXP2。主要研究結果如下： 1．蠟梅expansin基因CpEXP2的克隆。 通過隨機挑選蠟梅cDNA文庫測序，獲得了大小為1115bp的cDNA序列，序列分析表明，

3、該基因包含一個771bp的ORF框，編碼蛋白長257個氨基酸， BLASTX比對結果顯示，與α—expansin的同源性更高，初步推定所獲得的cDNA編碼Expansin擴展蛋白。命名CpEXP2。 2．植物表達載體的構建。 CpEXP2基因位于文庫克隆載體pTriplEx2上，活化菌液并用限制性內切酶SfiI酶切，同時酶切添加了SfiI酶切位點的環(huán)狀pMD-18TM，回收目的片段和載體并連接，經過酶切和PCR驗證，成

4、功構建了克隆載體：再用XbaI和SmaI分別雙酶切克隆載體和表達載體pC2301，回收目的片段和表達載體并連接，經酶切和PCR驗證，成功構建了含有目的基因的表達載體。 3．對擬南芥的遺傳轉化。 通過農桿菌介導將含有蠟梅擴張蛋白基因CpEXP2的植物表達載體轉入擬南芥中，經過Km+抗性篩選檢測，PCR檢測，證明CpEXP2基因已經初步整合入擬南芥基因組中，且T1代轉基因植株生長正常。 4．原核表達載體構建。

5、 設計帶BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的引物PCR擴增蠟梅CpEXP2基因，用BamHⅠ和HindⅢ分別雙酶切蠟梅CpEXP2基因和原核表達載體PET-28a，然后將蠟梅CpEXP2基因連接到原核表達載體PET-28a上，經過酶切與PCR驗證，表明已經成功構建了含有目的基因的原核表達載體。 5．CpEXP2基因在大腸桿菌中的誘導表達。 將構建好的原核表達載體轉入大腸桿菌中，通過合適的誘導條件，誘導CpEXP2基因在E．c