蠟梅expansin基因CpEXP2功能初步分析.pdf

1、Expansin基因家族是一類巨大的基因家族，主要分為α—expansin與β—expansin兩類，分別都具有很多的基因成員，廣泛的存在于多種植物中，目前已有大量的expansin基因被克隆。其所編碼的擴(kuò)張蛋白屬于細(xì)胞壁酶蛋白，在植物體中表達(dá)具有高度的專一性，其表達(dá)調(diào)控受到植物體自身發(fā)育進(jìn)程、外源激素以及環(huán)境因子的調(diào)控。研究表明，Expansin基因?qū)χ参锓N子萌發(fā)、根系生長、莖、葉片生長發(fā)育、果實(shí)成熟軟化、器官脫落等等方面都起著重要作

2、用，幾乎參與了整個(gè)植物生長發(fā)育過程。 本研究在本實(shí)驗(yàn)室原有研究基礎(chǔ)上，在蠟梅中克隆到了另外一個(gè)expansin基因，命名為cpEXP2。構(gòu)建了植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了T1代轉(zhuǎn)基因植株：構(gòu)建了原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)了CpEXP2。主要研究結(jié)果如下： 1．蠟梅expansin基因CpEXP2的克隆。 通過隨機(jī)挑選蠟梅cDNA文庫測(cè)序，獲得了大小為1115bp的cDNA序列，序列分析表明，

3、該基因包含一個(gè)771bp的ORF框，編碼蛋白長257個(gè)氨基酸， BLASTX比對(duì)結(jié)果顯示，與α—expansin的同源性更高，初步推定所獲得的cDNA編碼Expansin擴(kuò)展蛋白。命名CpEXP2。 2．植物表達(dá)載體的構(gòu)建。 CpEXP2基因位于文庫克隆載體pTriplEx2上，活化菌液并用限制性內(nèi)切酶SfiI酶切，同時(shí)酶切添加了SfiI酶切位點(diǎn)的環(huán)狀pMD-18TM，回收目的片段和載體并連接，經(jīng)過酶切和PCR驗(yàn)證，成

4、功構(gòu)建了克隆載體：再用XbaI和SmaI分別雙酶切克隆載體和表達(dá)載體pC2301，回收目的片段和表達(dá)載體并連接，經(jīng)酶切和PCR驗(yàn)證，成功構(gòu)建了含有目的基因的表達(dá)載體。 3．對(duì)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將含有蠟梅擴(kuò)張蛋白基因CpEXP2的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，經(jīng)過Km+抗性篩選檢測(cè)，PCR檢測(cè)，證明CpEXP2基因已經(jīng)初步整合入擬南芥基因組中，且T1代轉(zhuǎn)基因植株生長正常。 4．原核表達(dá)載體構(gòu)建。

5、 設(shè)計(jì)帶BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物PCR擴(kuò)增蠟梅CpEXP2基因，用BamHⅠ和HindⅢ分別雙酶切蠟梅CpEXP2基因和原核表達(dá)載體PET-28a，然后將蠟梅CpEXP2基因連接到原核表達(dá)載體PET-28a上，經(jīng)過酶切與PCR驗(yàn)證，表明已經(jīng)成功構(gòu)建了含有目的基因的原核表達(dá)載體。 5．CpEXP2基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。 將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，通過合適的誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)CpEXP2基因在E．c