棕櫚酸對(duì)大鼠INS-1β細(xì)胞的毒性作用及非諾貝特干預(yù)及機(jī)制研究.pdf

1、胰島素抵抗和胰島素分泌不足是2型糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。代謝因素諸如糖毒性、脂毒性參與胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭的病理過程，是促進(jìn)2型糖尿病發(fā)病的因素之一。長(zhǎng)期游離脂肪酸升高可引起機(jī)體胰腺或離體胰島的分泌功能障礙，即糖尿病發(fā)生的脂毒性學(xué)說。一方面增高的游離脂肪酸加劇胰島β細(xì)胞的凋亡；另一方面脂質(zhì)積聚在非脂肪組織，造成該組織的功能減退。Banting科學(xué)成就獎(jiǎng)獲得者M(jìn)cGarry教授甚至認(rèn)為糖尿病是起源于脂代謝異常的“糖脂病”(Diab

2、etes Mellipitus)，可見脂毒性在糖尿病發(fā)病中的重要作用。脂毒性機(jī)制及抗脂毒性藥物成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。 目前認(rèn)為脂毒性機(jī)制主要包括幾個(gè)方面：線粒體途徑，過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)途徑，氧化應(yīng)激途徑，神經(jīng)酰氨途徑等。近年來，對(duì)PPARα在脂毒性中的作用研究格外突出，主要有兩種不同的觀點(diǎn)：1.激活PPARα可介導(dǎo)脂肪酸的毒性作用；2.抑制PPARα從而抑制胰島素釋放。兩者的具體機(jī)制均不清楚。非諾貝特是經(jīng)典的降脂藥

3、物，可通過活化PPARα發(fā)揮作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，使用貝特類降脂藥除可降低血脂，還可改善部分糖尿病(DM)患者胰島的基礎(chǔ)高分泌狀態(tài)和葡萄糖刺激后的胰島素分泌。此作用除受益于改善周圍組織胰島素抵抗外，對(duì)胰島β細(xì)胞是否有直接作用引起了我們的極大興趣。 PDX-1(Pancreas/Duodenum Homeobox-1)，即胰腺十二指腸同源異型盒因子-1，是胰腺β細(xì)胞胰島素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育期主要調(diào)控胰島細(xì)胞分化，在成年哺

4、乳動(dòng)物中主要借助N末端與含TAAT序列的胰島素基因啟動(dòng)子A1、A3位點(diǎn)結(jié)合，并引導(dǎo)胰島素mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，調(diào)控胰島素的轉(zhuǎn)錄、翻譯和胰島素顆粒釋放，此外，PDX-1還能轉(zhuǎn)錄胰島素和調(diào)控胰島素相關(guān)基因如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT-2)和葡萄糖激酶(GK)等的表達(dá)，對(duì)胰島細(xì)胞內(nèi)分泌功能起重要調(diào)節(jié)作用。而葡萄糖刺激β細(xì)胞釋放胰島素，首先必須經(jīng)細(xì)胞膜上GLUT-2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在葡萄糖激酶作用下磷酸化，經(jīng)氧化分解代謝釋放ATP，

5、增加ATP/ADP比值，關(guān)閉ATP敏感的鉀離子通道，使細(xì)胞膜去極化誘發(fā)鈣離子內(nèi)流和胰島素顆粒釋放。研究發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸(FFAs)可以抑制大鼠胰島PDX-1表達(dá)，降低GLUT-2和胰島素水平。但是其上游機(jī)制不清。 AMPK(AMP-Activated Protein Kinase)，即AMP激活的蛋白激酶，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞能量代謝的一種重要的調(diào)節(jié)因子。AMPK最主要的生物學(xué)效應(yīng)是通過感受胞漿內(nèi)AMP/ATP比值的變化，調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化代謝

6、。在胰島β細(xì)胞，葡萄糖可通過氧化代謝直接改變細(xì)胞內(nèi)的腺苷酸水平，從而影響AMPK活性，表現(xiàn)為高糖抑制AMPK表達(dá)和活性。那么，高脂對(duì)β細(xì)胞AMPK的作用如何? 目的： 本研究利用體外培養(yǎng)的大鼠INS-1胰島β細(xì)胞，以體內(nèi)主要游離脂肪酸-棕櫚酸(Palmitic acid，P)為代表，以非諾貝特(Fenofibrate，F(xiàn))為PPARα激動(dòng)劑，MK886(M)為PPARα阻斷劑，對(duì)以下問題進(jìn)行探討： 1.觀察慢性棕

7、櫚酸處理對(duì)INS-1細(xì)胞的葡萄糖刺激的胰島素釋放功能的影響以及對(duì)PPARα、PDX-1、胰島素、GLUT2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討慢性脂毒性的機(jī)制。 2.觀察非諾貝特能否改善棕櫚酸對(duì)INS-1細(xì)胞的胰島素釋放功能以及對(duì)PPARα、PDX-1、胰島素、GLUT2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討非諾貝特改善脂毒性的機(jī)制。 3.探討在INS-1細(xì)胞中，PPARα與PDX-1的關(guān)系。 4.觀察慢性棕櫚酸處理對(duì)AM

8、PKα表達(dá)與活性的影響，探討AMPKα在INS-1細(xì)胞脂毒性的地位與作用。 方法： 1.INS-1細(xì)胞的培養(yǎng)和分組：INS-1細(xì)胞在RPMI1640(添加10％FBS，2 mML-谷氨酸，50 μM β巰基乙醇)培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)分為六組：C組，正常對(duì)照組；P組，0.2 mM棕櫚酸組；F組，5×10-6 M非諾貝特；PF組，P與F共培養(yǎng)；M組，1×10-6 M MK886；PM組，P與M共培養(yǎng)。處理時(shí)間：48小時(shí)。

9、2.細(xì)胞形態(tài)的觀察：INS-1細(xì)胞分組培養(yǎng)48h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 3.細(xì)胞活力的檢測(cè)：INS-1細(xì)胞分組培養(yǎng)后，使用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化。 4.INS-1細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素釋放功能的測(cè)定與評(píng)價(jià)：INS-1細(xì)胞種于24孔板中，分組處理48小時(shí)后，在葡萄糖濃度為3 mM、20 mM的KRB緩沖液分別孵育20min，收集上清，放射免疫方法測(cè)定分泌的胰島素水平分別為基礎(chǔ)胰島素分泌(BIS)和葡萄糖刺

10、激的胰島素分泌(GSIS)，計(jì)算GSIS/BIS比值即胰島素釋放指數(shù)(ISI)。 5.PPARα、PDX-1、胰島素、GLUT2的檢測(cè)：Real-time PCR檢測(cè)INS-1細(xì)胞PPARα、PDX-1、胰島素、GLUT2 mRNA的表達(dá)。Western blot檢測(cè)PDX-1、GLUT2蛋白表達(dá)。免疫沉淀檢測(cè)PPARα蛋白表達(dá)。放射免疫方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素含量。免疫熒光檢測(cè)PDX-1和胰島素的定位與表達(dá)。凝膠遷移率試驗(yàn)(EMS

11、A)檢測(cè)PPARα與PDX-1的轉(zhuǎn)錄結(jié)合活性。 6.RPMI1640培養(yǎng)過表達(dá)PDX-1的Pdx-1＃6細(xì)胞株，加以不同濃度的強(qiáng)力霉素(Doxycyline)(0，75，150，500 ng/ml)，使PDX-1 mRNA及蛋白表達(dá)呈逐級(jí)遞增表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)PPARα、胰島素、GLUT2 mRNA表達(dá)的變化。 7.AMPKα亞單位的檢測(cè)：Real-time PCR檢測(cè)INS-1細(xì)胞AMPKα1亞單位和AMPKα2亞

12、單位的mRNA水平；Western blot檢測(cè)總AMPKα亞單位(T-AMPKα)和磷酸化AMPKα(P-AMPKα)亞單位的蛋白水平。 結(jié)論： ①在生理或病理狀態(tài)(高脂環(huán)境)下的INS-1細(xì)胞中，PPARα可以陽性調(diào)節(jié)PDX-1的表達(dá)，并且這種調(diào)節(jié)可能是通過PPARα與PDX-1啟動(dòng)子的直接結(jié)合發(fā)揮作用的。 ②慢性棕櫚酸處理可抑制PPARα，降調(diào)PDX-1及下游信號(hào)的表達(dá)，使INS-1細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素釋