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文檔簡介
1、研究背景:
糖尿病的患病率逐年上升,目前已成為嚴重威脅人類健康的疾病之一,胰島β細胞凋亡增加是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的關鍵因素[1]。近年來有研究表明,2型糖尿病患者體內長期高水平的游離脂肪酸(free fatty acids, FFAs),特別是飽和脂肪酸可以引起胰島素抵抗、胰島β細胞功能紊亂,以及β細胞凋亡的增加,進而加重糖尿病[2-4]。
硫氧還蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin interacting pro
2、tein, TXNIP)又名VDUP1(Vitamin D(3) up-regulated protein1)和 TBP2(Thioredoxin-binding protein-2),屬于α抑制蛋白家族,是目前發(fā)現的唯一內源性的硫氧還蛋白(Thioredoxin, Trx)結合抑制蛋白,在糖尿病各組織中其表達均顯著升高,已有大量研究證明高糖可引起TXNIP表達明顯升高,并介導β細胞功能損傷和凋亡[5-7]。
但是,作為糖尿病
3、主要損傷因素之一的游離脂肪酸,其對TXNIP表達的影響,以及不同飽和程度的游離脂肪酸對TXNIP表達的可能差別目前尚不清楚。因此本課題旨在研究不同飽和程度的脂肪酸對INS-1胰島細胞TXNIP表達的影響,并分析其可能機制。
目的:
1.使用不同飽和程度的游離脂肪酸孵育INS-1細胞,觀察不同類型脂肪酸對INS-1胰島細胞凋亡及TXNIP表達的影響。
2.分析脂肪酸調節(jié)TXNIP表達的可能機制。
方
4、法:
1.實驗分組:將正常培養(yǎng)的INS-1細胞分為四組:分別是正常對照組(含0.55%fatty acid free-BSA的RPMI1640培養(yǎng)基)、飽和脂肪酸-軟脂酸組(0.5 mmol/L軟脂酸+0.55%fatty acid free-BSA)、單不飽和脂肪酸-棕櫚油酸組(0.5 mmol/L棕櫚油酸+0.55%fatty acid free-BSA)、多不飽和脂肪酸-DHA組(0.5 mmol/L DHA+0.55%
5、fatty acid free-BSA),均于培養(yǎng)24 h后收集細胞進行指標測定。
2.采用Real-time PCR方法測定FFAs處理后INS-1細胞TXNIP mRNA表達量。
3.采用Western blot方法檢測FFAs處理后INS-1細胞TXNIP、Cleaved caspase-3、Caspase-3、ChREBP、FOXO1、p-NF-κB蛋白表達。
4.采用免疫熒光技術檢測FFAs處理后
6、INS-1細胞中ChREBP蛋白表達。
5.使用Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術檢測INS-1細胞凋亡情況。
結果:
1.不同飽和程度的FFAs對INS-1細胞TXNIP表達的影響不同。
與對照組相比,飽和脂肪酸軟脂酸組TXNIP mRNA和蛋白表達均顯著上調,而不飽和脂肪酸棕櫚油酸組和DHA組INS-1細胞TXNIP表達均沒有明顯的改變(見圖1)。
如圖2所示,軟脂酸引
7、起的TXNIP的蛋白表達從18 h開始增加,并于24 h達到最高。36 h時,軟脂酸誘導的TXNIP表達降低到原蛋白水平。而棕櫚油酸和DHA在12 h、18 h、24 h、36 h不同的時間點對TXNIP表達與對照組相比均無統(tǒng)計學差異。
2. FFAs由于其飽和程度的不同對INS-1細胞凋亡也具有不同的影響。
如圖3所示,軟脂酸組Cleaved caspase-3/caspase-3的比值與對照組相比明顯增加。棕櫚油
8、酸組和DHA組Cleaved caspase-3/caspase-3比值與對照組相比無顯著性差異。流式細胞術結果顯示,軟脂酸組INS-1細胞的凋亡指數明顯增加,而棕櫚油酸組和DHA組對INS-1細胞凋亡的影響與對照組相比無統(tǒng)計學差異(見圖4)。
3.軟脂酸對轉錄因子ChREBP和FOXO1蛋白表達的影響。
使用Western blot和免疫熒光方法研究發(fā)現,與對照組相比軟脂酸組ChREBP蛋白表達顯著上調,轉錄因子
9、FOXO1蛋白表達降低。(見圖5-6)
4.軟脂酸調節(jié)INS-1細胞TXNIP蛋白表達與NF-κB磷酸化相關。
與對照組相比,軟脂酸組p-NF-κB p65蛋白表達量明顯增加(見圖7)。加入 NF-κB抑制劑PDTC后,與不加抑制劑組相比,軟脂酸孵育后引起的TXNIP mRNA和蛋白水平的上調受到明顯的抑制(見圖8)。同樣,使用一種多肽類的NF-κB抑制劑SN50也可降低軟脂酸誘導的TXNIP表達上調(見圖9)。同時
10、發(fā)現, PDTC能夠顯著降低軟脂酸誘導的ChREBP表達上調(見圖10),而對軟脂酸下調FOXO1的表達沒有影響(見圖11)。
5. p38 MAPK參與軟脂酸誘導的TXNIP表達上調。
與不加抑制劑組相比,使用p38 MAPK抑制劑SB203580可顯著抑制軟脂酸處理后引起的INS-1細胞TXNIP mRNA和蛋白水平的增加(見圖12)。同時, SB203580也可阻斷了軟脂酸誘導的p-NF-κB p65蛋白表達上
11、調(見圖13),以及軟脂酸對轉錄因子ChREBP和FOXO1蛋白表達的調節(jié)作用(見圖14,15)。
結論:
1.飽和脂肪酸軟脂酸可能通過誘導TXNIP表達上調,進而促進了INS-1胰島細胞凋亡。而不飽和脂肪酸棕櫚油酸和DHA對TXNIP表達以及INS-1細胞凋亡均無顯著作用。
2.軟脂酸上調TXNIP表達的機制與p38 MAPK/NF-κB/ChREBP信號通路有關,FOXO1可能也參與了TXNIP的調節(jié)。
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