胃癌-樹突狀細胞融合疫苗刺激T淋巴細胞抗胃癌SGC7901細胞的實驗研究.pdf

1、目的：胃癌是臨床常見的惡性腫瘤，采用手術、放療、化療等傳統(tǒng)治療手段預后仍較差。近年來，樹突狀細胞(DC)因其強大的抗原提呈及免疫激發(fā)能力引起人們廣泛重視。胃癌細胞缺乏特異性腫瘤抗原且抗原性弱，以往的研究手段如癌細胞凍融、超聲粉碎、癌細胞表面抗原酸洗脫等方法所能獲取的腫瘤抗原量及刺激DC激發(fā)后續(xù)抗腫瘤免疫應答的能力均較弱。為實現(xiàn)腫瘤抗原對DC的更有效刺激，提高DC抗原提呈及免疫激發(fā)能力，實現(xiàn)更有效的腫瘤生物治療效應，由于自體瘤苗的制備時采

2、集自身DC通常會受到采集患者細胞的困難，而異體DC可以從儲備的健康志愿者外周血單核細胞中獲得，可避免使患者在接受免疫治療前采集自身外周血的缺陷。本實驗將從健康人外周血富集白細胞層中獲得的單個核細胞( PBMC)所誘導培養(yǎng)的DC與胃癌SGC7901細胞相融合，觀察細胞瘤苗刺激自體和異體T淋巴細胞的增殖性及對SGC7901胃癌細胞的殺傷性，希望能為胃癌DC瘤苗免疫治療提供新的思路和理論基礎，同時也是對無償捐獻血液的一個合理利用，開辟了寶貴的

3、血液資源的有效利用途徑。 方法：第一部分：人外周血富集白細胞層來源的樹突狀細胞的培養(yǎng)與鑒定。從健康人的外周血富集白細胞層中獲取貼壁細胞，利用GM-CSF、IL-4、TNF-α體外定向誘導分化，獲取成熟DC，并對其形態(tài)及表面標志進行鑒定。第二部分：胃癌SGC7901細胞-樹突狀細胞融合疫苗的制備。對應用健康志愿者的外周血白膜層分離制備DC，再與SGC7901胃癌細胞融合制備DC融合性細胞瘤苗，使用HAT/HT選擇培養(yǎng)系統(tǒng)篩選培養(yǎng)，

4、獲得純凈的融合細胞。第三部分：異體T淋巴細胞經(jīng)DC融合性細胞瘤苗刺激后的增殖性及對SGC7901胃癌細胞殺傷效應的研究。MTT比色法檢測DC融合性細胞瘤苗激活同種同體和同種異體T淋巴細胞的增殖能力及體外殺傷胃癌SGC7901細胞的細胞毒作用。 結果：1、健康人外周血(200ml)富集白細胞層所分離、誘導成熟的DC，每份可以獲得(3.87±0.31)×107個成熟的DC，其表面分子表達水平可達CD83(48.54+2.12)％，C

5、Dla(50.59±5.06)％，CD86(63.04±4.42)％，HLA-DR(89.12±3.99)％。2、DC融合性細胞瘤苗具有類似于DC的懸浮生長特性，未保留親代SGC7901胃癌細胞的貼壁生長特性。DC和SGC7901胃癌細胞融合后經(jīng)光鏡觀察，可見大量體積明顯增大的融合細胞懸浮生長于培養(yǎng)基中，胞漿透明，細胞邊界清晰，胞膜完整，部分融合細胞體積巨大。經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)2周、HT選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)1周后光鏡觀察，可見細胞

6、數(shù)量明顯減少，僅剩少量體積較大、胞膜完整、呈均勻圓形懸浮生長的融合細胞存在，細胞表面未見明顯的毛刺樣突起，細胞內(nèi)有單個存在的較親代細胞明顯增大的細胞核。3、DC融合性細胞瘤苗對自體和異體T淋巴細胞的增殖能力，隨融合細胞與淋巴細胞的比例增加而增殖能力逐漸增加，在相同效靶比情況下，兩種T淋巴細胞的增殖效應沒有顯著差異。DC融合性細胞瘤苗體外激活的自體和異體T淋巴細胞對SGC7901胃癌細胞的殺傷率沒有顯著差異。體外細胞毒實驗中，DC融合性細

7、胞瘤苗激活的兩種T淋巴細胞對SGC7901胃癌細胞的殺傷率均比未激活的T淋巴細胞明顯增高，其兩者間沒有明顯差異。 結論：1、健康人外周血富集白細胞層所分離出的單個核細胞，經(jīng)GM-CSF、IL-4和TNF-α細胞因子誘導培養(yǎng).可獲得具備典型特征及細胞表型的DC。2、胃癌細胞SGC7901細胞與DC經(jīng)PEG誘導融合，HAT/HT選擇培養(yǎng)，可獲得純凈融合細胞。3、融合細胞具有類似于DC的懸浮生長特性，而不保留親代SGC7901胃癌細胞