gp96-多肽復(fù)合物樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗抗胃癌實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其預(yù)后較差,生存率低,如何改善預(yù)后,提高生存率是臨床上亟待解決的問(wèn)題.DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,在抗腫瘤免疫中起重要作用.負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗可以誘導(dǎo)出特異性抗腫瘤免疫效應(yīng),這在許多動(dòng)物及部分臨床實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí).但現(xiàn)在常用的DC疫苗只是取得了部分效果,其原因可能與其抗原遞呈及活化T細(xì)胞的能力較弱有關(guān).從腫瘤組織中提取的gp96結(jié)合有多種腫瘤特有的抗原肽,抗原肽可通過(guò)DC表面gp96受體

2、,進(jìn)入MHCⅠ類分子遞呈途徑,激發(fā)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答.Gp96腫瘤疫苗的實(shí)驗(yàn)研究正在展開(kāi),研究顯示用gp96-多肽復(fù)合物作為疫苗進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn),取得了較明顯的效果.然而,在腫瘤患者體內(nèi),DC數(shù)量減少,功能缺陷,直接用gp96-多肽復(fù)合物作疫苗,其抗原提呈效力受到影響.因此,在體外用gp96-多肽復(fù)合物負(fù)載DC后制備的DC疫苗有可能會(huì)產(chǎn)生更好的效果,目前尚未見(jiàn)這方面的報(bào)道.為此,該課題首先探討gp96在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義;從胃癌組織

3、中純化gp96-多肽復(fù)合物負(fù)載DC,以觀察gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗的生物學(xué)特性及特異性抗胃癌CTL反應(yīng),并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討.方法:1.收集第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院普外科2002年1月至2002年10月間行外科手術(shù)切除的50例新鮮胃癌標(biāo)本,以及同一患者距腫瘤約3~5cm的癌旁正常組織,50例標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為胃癌;應(yīng)用免疫組化及原位雜交技術(shù),檢測(cè)gp96在胃癌組織中的表達(dá),并分析其與臨床病理類型的關(guān)系.2.應(yīng)用液相層析方法從胃

4、癌組織中純化gp96-多肽復(fù)合物;用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行性質(zhì)鑒定;將純化得到的gp96-多肽復(fù)合物負(fù)載自體外周血來(lái)源的DC,制備gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗,并與負(fù)載凍融粗提抗原的DC疫苗和未負(fù)載腫瘤抗原的DC作對(duì)比;采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗進(jìn)行表型檢測(cè).3. 采用3H-TdR摻入法檢測(cè)gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖能力;ELISA技術(shù)檢測(cè)gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗培養(yǎng)

5、上清中IL-12的水平以及gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗致敏的效應(yīng)T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-10的能力;酶消化法原代培養(yǎng)同一患者的胃癌細(xì)胞,并以胃癌細(xì)胞株SGC7901和無(wú)關(guān)肝癌細(xì)胞株HepG2作對(duì)照,采用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗誘導(dǎo)的特異性對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng).結(jié)果:1.胃癌組織和癌旁正常組織內(nèi)均表達(dá)gp96,胃癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(P< 0.01);gp96的表達(dá)與組織學(xué)類型顯著相關(guān),不同分化程度

6、的胃癌組織之間,gp96的表達(dá)存在顯著差異(P< 0.05);與腫瘤分期顯著相關(guān),臨床Ⅲ、Ⅳ期顯著高于Ⅰ、Ⅱ期(P< 0.05);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P< 0.05);而gp96表達(dá)與性別、年齡及腫瘤部位無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05).2.用親和層析及兩次離子交換層析可從胃癌組織中純化出gp96-多肽復(fù)合物,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot得到鑒定;負(fù)載gp96-多肽復(fù)合物的DC疫苗其表面

7、分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR的表達(dá)分別為79.3±4.1﹪、84.3±2.4﹪、85.7±3.2﹪和83.4±2.9﹪,顯著高于對(duì)照組(P< 0.05).3. Gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力比對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P< 0.01);其培養(yǎng)上清中IL-12的含量為788.3±6.7pg/ml,顯著高于對(duì)照組(P< 0.01);gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗誘導(dǎo)的效應(yīng)T細(xì)胞分泌IFN-γ的量為2875±177

8、.66 pg/ml,顯著高于對(duì)照組(P< 0.01),分泌IL-10的量為36±6.72pg/ml,顯著低于對(duì)照組(P< 0.01),二者之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= - 0.915, P<0.01);gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗誘導(dǎo)的自體抗原特異的CTL對(duì)原代培養(yǎng)胃癌細(xì)胞的殺傷效率為58.47±10.71﹪,顯著高于對(duì)照組(P< 0.01);對(duì)原代培養(yǎng)胃癌細(xì)胞的殺傷效率顯著高于對(duì)SGC 7901細(xì)胞(P< 0.01);而對(duì)其它無(wú)關(guān)腫

9、瘤細(xì)胞則無(wú)明顯殺傷作用.結(jié)論:1.gp96在胃癌組織和癌旁正常組織內(nèi)均有表達(dá),在胃癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織,并且與組織學(xué)類型、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),提示gp96的表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其表達(dá)水平可以作為判斷胃癌預(yù)后的參考指標(biāo)之一.2.從胃癌組織中可以純化出gp96-多肽復(fù)合物,DC負(fù)載gp96-多肽復(fù)合物后可明顯上調(diào)其表面分子的表達(dá).3.gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗具有較強(qiáng)的刺激T淋巴細(xì)胞增殖及分泌IL-12的能力

10、.4.gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗可促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ及抑制IL-10的產(chǎn)生,提示可誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1漂移,對(duì)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫具有增強(qiáng)作用.5.gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗能誘導(dǎo)出較強(qiáng)的對(duì)自體胃癌細(xì)胞的CTL反應(yīng),對(duì)其它無(wú)關(guān)腫瘤細(xì)胞則無(wú)顯著作用,提示gp96-多肽復(fù)合物DC疫苗所誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)具有高度的特異性.6.gp96-多肽復(fù)合物由于結(jié)合有腫瘤細(xì)胞特有的各種抗原肽,在目前很難鑒定來(lái)自腫瘤組織特異抗原的情況下